第八章 现代生物技术育种

第八章现代生物技术育种第一节生物技术应用于育种的必要性第二节组织培养第三节植物原生质体培养和细胞融合第四节基因工程第五节分子标记及其在育种中的应用主要内容第一节生物技术应用于育种的必要性（一）生物技术的概念 以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计、构建、培育具有预期性状的新物种、新品种、新品系，以及与工程原理相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合技术体系。（二）生物技术应用于育种的必要性人类二十一世纪面临的三大问题：世界人口不断增加、石化能源的日趋枯竭、环境污染的加剧传统育种方法存在局限生物技术的创造性

打破自然生殖隔离，生物可共享一个基因库有目的地进行基因重组，克服不良连锁有效克服环境影响，选择更可靠

生物技术应用于作物育种，可以解决传统育种的一些特殊困难，扩大育种的基因来源，提高鉴定和选择的可靠性，加快育种进程，加速繁殖，提高育种效率等，对于解决新世纪人口与食物问题，以及生物能源问题，具有十分重要意义。（三）生物技术在育种中应用的意义现代生物技术发展简况50年代：Watson&Click发现DNA双螺旋结构，揭开生物遗传学分子结构和遗传信息之秘。70年代：DNA重组技术取得成功，细胞融合技术、生物反应技术(生物反应器)取得突破性发展，带来了一场深远的生物技术革命。90年代：基因工程和分子生物技术取得了大批应用成果——转基因植物及动物、基因工程药物等。1962年，Arber发现大肠杆菌对外来侵入的DNA有限制作用，这是由于菌体内有一种酶，对外来的DNA起切割、分解的作用，从而预言DNA限制性内切酶的存在。1966年Weiss和Richardson发现了DNA连接酶。1968年，Smith分离出第一个内切酶。1971年，Nathans应用Smith的内切酶切割SV-40病毒的DNA，获得了第一个DNA的内切图谱（通称“物理图谱”physicalmap）。1978年的诺贝尔医学奖

1972年，伯格（Berg）等人用这两种酶成功地进行了λ-噬菌体与SV-40病毒DNA的体外拼接。

1977年，基因工程正式宣布成功——吉尔伯特（Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素（这是两种有用的药物）的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

1978年的诺贝尔化学奖（其中吉尔伯特的获奖主要是因为DNA测序方法的研究）。同时获奖的还有桑格Sanger（2度获奖）

，他完成了φX噬菌体DNA的全测序。

自70年代末以来，基因工程发展迅速。1980年，Kemp和Hall将大豆种子的贮藏蛋白基因引入向日葵中，得到“向日豆”（sunbean）。Wilmut研究小组继克隆羊多莉之后，将人的AAT蛋白基因导入绵羊体内，使羊奶中含有人的AAT蛋白一头这样的转基因羊，获得50万英镑。概念是指在无菌条件下，将离体的植物材料培养于人工培养基上，并给以适当的培养条件，使之形成完整植株或生产出具有一定经济价值的生物产品的一种技术。内容及范畴植株培养、茎尖培养、胚培养、胚珠和子房培养、花药与花粉培养、离体器官培养、胚乳培养、细胞培养、原生质体培养、离体授粉受精第二节组织培养植物组织培养概况及其在园林植物育种中的应用1902Haberlandt“植物细胞全能性”的提出1904Hanning离体培养萝卜和辣根菜获得成功1933李继㣚发现3mm大小的银杏胚可以在离体培养下正常生长1934White建立番茄根尖的无性系，获得突破，发现了B族维生素和生长素的作用40-50年代，Skoog等人发现CTK可以控制芽分化1958Reinert和Steward分别报道胡萝卜愈伤组织-体细胞胚-完整植株经过40年的发展，园林植物育种中发展出：利用茎尖等培养技术进行快繁和工厂化育苗利用茎尖微芽培养获得无病毒植株结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选利用花药与花粉培养进行单倍体育种利用胚乳培养获得三倍体植株利用胚胎培养和体细胞杂交等克服远缘杂交障碍利用离体培养进行种质资源的长期培养和远距离运输通过组织培养提供生物技术育种的中间材料(1)选择生长健壮的3cm～6cm长的新芽作外植体。(2)用消了毒的利刃将新芽从从母体切下。第三节植物原生质体培养和细胞融合一、原生质体培养原生质体（Protoplast）：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。（一）原生质体的分离（二）原生质体的分离方法（三）原生质体的纯化（四）原生质体的培养拟南芥原生质体（二）原生质体的分离方法机械分离法高渗糖溶液预处理，原生质体收缩，机械破碎Klercker1982分离藻类原生质体可避免酶制剂对原生质体的破坏，但完整率不高且仅对高度液泡化细胞适用酶解分离法Cocking1960常用：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、胼胝质酶、EA3-867（上海植物生化所复合酶）（三）原生质体的纯化1、过滤-离心法44-169μm的筛网去除大的组织碎片和残渣900-4500r/min，2min，收集沉淀简单，但沉积造成挤压易导致原生质体破碎2、漂浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液，离心后去除下层残渣3、界面法采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中（四）原生质体的培养固体培养法（平板培养法）Nagata和Takebe采用1mm薄层固体培养基培养烟草有利于定点观察单个原生质体的胞壁再生浅层液体培养法Kameya1972年用3-4ml培养液培养胡萝卜原生质体双层培养法Maletzki（1973）甘蔗和李文安（1979）黄花烟草培养成功二、原生质体融合两种异源（种、属间）原生质体，在诱发剂诱发下相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，进一步培育成杂种植物体，称为原生质体融合或细胞杂交。若取材为体细胞则称体细胞杂交。（一）原生质体融合的类型自发融合、诱导融合（二）诱导原生质体融合的方法及融合剂盐类融合法、高钙和高pH融合、PEG法、电场融合等（三）原生质体融合的步骤参阅文献（四）融合体的类型自体融合、异体融合（五）细胞杂种的选择和鉴定互补选择法、可见标记法（六）细胞杂种的再生和鉴定形态鉴定、核型分析、分子标记鉴定相关文献：曹雪，戴忠良，秦文斌，潘跃平.植物原生质体融合技术的研究进展.中国农学通报，2016，32(25)：84-90张金鹏，韩玉珠，张晓旭，张广臣.蔬菜原生质体培养及融合的研究现状与展望.北方园艺，2015（04）:192-195孙宇涵，王欢，李云.浅谈林木体细胞融合技术.中国农学通报，2016，32(4)：136-143（四）融合体的类型细胞杂种胞质杂种对称融合不对称融合简单来说，“三父母胚胎”或“三父母婴儿”技术，指的是从希望生育的母亲卵子中取出含遗传信息的细胞核，随后将其注入去掉细胞核的捐赠者的卵子内，然后再通过体外受精的方式让这一改造过的卵子受精。第三节基因工程一、基因工程的概念以及研究概况二、植物基因工程的一般程序和方法三、基因工程在园林植物育种中的作用一、基因工程的概念以及研究概况概念 基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄主细胞内，且能持续稳定的繁殖。概况1972P.Berg完成λ-噬菌体与SV-40病毒DNA的体外拼接，第一例重组DNA分子1973H.Boyer&S.N.Cohen将外源DNA插入pSC101，并进一步引入大肠杆菌，开创了基因工程的研究1985Horsch等首创叶盘法转化，并获得转基因植株植物基因工程的优势从基因水平上修饰遗传物质，定向改造遗传性状，提高了育种的目的性和精确性打破物种间的生殖隔离障碍，实现自然界基因资源的共享，拓展了育种的范围在很大程度上缩短了育种周期，尤其是木本植物植物基因工程在植物遗传改良中的应用进展用于基因转化的材料增加原生质体、悬浮培养细胞、愈伤组织、茎段、胚轴、茎尖、叶片、未成熟胚、种子、花序等遗传转化方法越来越多，转化技术日臻成熟农杆菌介导法、基因枪法、显微注射、PEG法、电击法、超声波法、真空浸润法、碳硅纤维介导法等转基因植物种类逐年增加35个科近200种矮牵牛、金鱼草、石竹、非洲菊、百合、一品红、杨树、火炬松、刺槐等等玉米、水稻、大豆、烟草、马铃薯、矮牵牛、香石竹等作物已有上百个商业化生产每年超过300亿美元的销售额二、植物基因工程的一般程序和方法目的基因的分离与克隆植物表达载体构建植物遗传转化转基因植株的检测和鉴定①目的基因的分离与克隆分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。目的基因的获得的途径：从基因文库中筛选利用分子标记进行基因定位克隆应用PCR技术扩增分离特定的DNA利用转位因子，分离目的基因a、图位克隆技术

染色体步移（chromosomewalking)技术

染色体登陆（chromosomelanding)技术b、转座子或T-DNA标签法c、PCR扩增克隆d、以mRNA为基础的基因克隆e、功能克隆用于植物改良的主要外源基因抗除草剂基因抗虫基因抗病基因抗逆境基因改良品质基因抗除草剂基因抗草丁膦(glufosinate)转基因冬油菜；抗草甘膦(glyphosate农达)转基因大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜；抗磺酰脲类转基因大豆、棉花；抗溴苯腈转基因油菜、小麦、棉花、烟草；抗阿特拉津(Atrazine)转基因大豆、玉米；抗唑啉酮类除草剂转基因玉米、油菜、甜菜、小麦、水稻；脱卤素酶转基因抗除草剂作物；此外，解溴苯腈毒害的BXn基因和解2,4-D毒害的tfDA基因等也在抗除草剂作物选育中获得成功的表达。图苏云金杆菌的芽孢和伴孢晶体

抗虫基因比利时植物遗传公司的科学家于1987年首次将苏云金杆菌(Bacillusthunringiensis)毒蛋白基因导入烟草中得以表达，表现出对一龄烟草夜蛾幼虫的抗性。经过10多年的发展，已取得较大的进展，并实现了大面积的商业化应用。抗虫基因类别：

抗虫基因有两类：一类是Bt杀虫蛋白基因，来自苏云金芽孢杆菌，杀虫毒性为伴孢晶体蛋白，对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫有毒，现已导入棉花、玉米、水稻、烟草、番茄、马铃薯、胡桃、杨树、落叶松等；另一类是蛋白酶抑制剂基因，可抑制蛋白酶活性，干扰害虫消化作用而导致其死亡，是植物对虫害的自卫反应，主要有丝氨酸类、半胱氨酸类、含金属类、天冬酰氨类，现已导入棉花、烟草、番茄、龙葵等。应用情况目前已获得转化植株的蛋白酶抑制剂基因有：大豆胰蛋白酶抑制剂基因(SKTI)豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)慈菇胰蛋白酶抑制剂基因(API)外源凝集素基因(GNA)等几类；其中获得转CpTI基因的植物种类最多，有苹果、油菜、水稻、番茄、向日葵、甘薯、烟草、马铃薯等10余种。郭三堆实验室新研制的sGKZ8杂交抗虫棉中国“抗虫棉”之父抗病基因1986年，美国Beachy研究小组首次将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因(CP)导入烟草，培育出抗TMV的烟草植株，开创了抗病毒育种的新途径。通过导入植物病毒的外壳蛋白基因来提高植物的抗病毒能力的技术，已在多种植物病毒中进行了试验。如梁小友等（1994）将抗病毒的CMV-cp基因和抗虫的Bt-toxin基因导入番茄，获得了再生的番茄植株。赵淑珍等(1994)利用卫星DNA的互补DNA构造成抗CMV的转基因番茄，这种番茄能够干扰CMV的复制，减轻发病症状，表现出对CMV的显著抗性，且这种抗病性可以遗传。

抗烟草花叶病毒蛋白基因抗白叶枯病基因抗棉花枯萎病基因抗烟草花叶病毒基因黄瓜花叶病毒基因以及小麦抗赤霉病、纹枯病和根腐病基因，花生、番茄青枯病，大白菜软腐病，柑橘溃疡病，桑树、桉树青枯病、根肿病等研究。目前被导入的抗病基因有：获得转基因抗病性状的植物有：烟草、番茄、棉花、大麦、燕麦草、小麦、马铃薯、水稻等。除了外壳蛋白基因外，近年来国内外正在摸索多种抗病毒基因工程的新方法，包括卫星RNA、复制酶基因以及病毒复制抑制因子、核糖体失活蛋白、致病相关蛋白、核酸酶等。我国培育的转基因抗黄瓜花叶病毒甜椒和番茄已实现商品化生产。细菌病和真菌病的抗病基因工程研究基本上还处于实验室阶段。抗环斑病(PapayaRingspotvirus,PRSV)转基因木瓜

抗逆境基因与抗(耐)寒有关的脯氨酸合成酶基因鱼抗冻蛋白(AFP)基因拟南芥叶绿体3一磷酸甘油酰基转移酶基因与抗旱有关的茧蜜糖合成酶基因一些植物去饱和酶基因等。耐盐碱相关基因如耐1％NaCl的苜蓿(Medicagosativa)，耐0.8％NaCl的草莓，耐2％NaCl的烟草刘岩等获得了耐盐性明显提高的转基因玉米植株。张荃等获得了耐盐性提高的转基因番茄。新疆石河子大学生物工程部用花粉管通道法将芦苇和细菌的耐盐碱基因导入小麦，育成抗盐碱转基因小麦253，282，221等新品系，耐盐碱力明显加强。Sakamoto等获得了两种耐盐性和耐寒性均提高的水稻转基因植株。Capell等利用CaMV35S启动子在水稻中过量表达Ade，在干旱胁迫下抑制了叶绿素的降解，提高了抗旱性。Steponkus等发现转入Cor15α的拟南芥的叶绿体和原生质体耐寒性提高。Mekersie等将从烟草中克隆的Mn-SOD的cDNA置于35S启动子下转入苜蓿，转基因苜蓿经两个冬季的田问试验比较，越冬成活率大于未转移植株，平均提高25％。转基因耐盐碱玫瑰改良品质基因品质改良主要涉及蛋白质的含量、氨基酸的组成、淀粉和其它多糖化合物以及脂类化合物的组成。富含蛋氨酸的转基因烟草、直链淀粉含量降低的转基因水稻、月桂酸含量高达40％的转基因油菜都相继成功，有的已进入大田试验。延熟转基因番茄和改变花色转基因玫瑰也已商品化。“金米的故事”：德国科学家从水仙、真菌、豆子等中找到四种促进新陈代谢的酶，移植到普通水稻中，这样获得的新水稻品种富含铁、锌和可转化为维生素A的胡萝卜素，能防止贫血和维生素A缺乏症，米粒呈金黄色。这告诉我们转基因技术改良大米品质，解决人类营养不良已成为可能。英国科学家（2008）培育出一种转基因“超级番茄”

“超级番茄”呈深紫色，转了金鱼草中花青素合成关键基因。而我国学者将玉米醇溶蛋白(Zein)基因导入马铃薯后，田间转基因植物的块茎中必需氨基酸含量提高10％以上，而含硫氨基酸的增加尤为显著。

紫色转基因石竹花“月影”长春的转基因香雪兰新品种②植物表达载体构建目的基因必须经限制性酶酶切后与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，才可以高效率地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体BAC、YAC等。1.具复制原点，在宿主细胞中能独立复制，能带动携带的外源DNA片段复制。2.具有多克隆位点，即具有多种限制酶切点，每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。3.至少具有一个选择标记基因（具抗菌素抗性基因）

，这个基因是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因，而宿主细胞则没有这种基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。4.易从宿主细胞中回收。5.具较小的分子质量和较高的拷贝数。

作为载体，需具备的条件：1、细菌质粒常用载体2、

噬菌体载体（用于基因库构建）3、柯斯质粒部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究

4、穿梭质粒上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体（BAC)载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的。5、细菌人工染色体YAC可接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具6、酵母菌人工染色体7、Ti质粒及其衍生载体③植物遗传转化植物组织和愈伤组织的遗传转化基本方法：土壤农杆菌转化技术：Ti质粒

主要用于双子叶植物利用基因枪进行基因转化

主要用于单子叶植物通过原生质体的基因转化

电击法、PEG法、显微注射法、聚乙二醇法、显微注射法、超声波法、激光微束法等花粉管通道法*农杆菌介导法

有两种农杆菌:根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）发根农杆菌(A.Rhizogenes)被广泛用于植物转基因。早期的双子叶植物的转基因工作主要是采用这一方法进行的。1994年以后，由于乙酰丁香酮及其类似物的发现，农杆菌介导介导法又在单子叶植物中获得了突破性的进展，使这一方法得到更为广泛的应用。

农杆菌的自然侵染过程农杆菌介导的转化根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片的一般操作1.根癌农杆菌过夜培养并稀释到一定浓度2.将表面消毒的叶片切成小块3.叶片小块在上述根癌农杆菌液中浸泡几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。4.从菌液中捞出小块，培养基中培养2天。5.在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转化的细胞分化出芽。6.将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。7.将完整的转基因植株移栽到土壤中。/v_show/id_co00XMTcxNDA4MDQ=.html基因枪法美国伯乐公司(Bio-Rad)PDH1000型基因枪花粉管通道法将从植物提取的总DNA在开花前后加到受体植物的柱头上，在受精的同时，外源DNA经过花粉管与花粉一起进入合子。在新的合子中携带有外源DNA。表常用植物基因转化方法特点比较④转基因植株的检测和鉴定A、转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因

DNA分子杂交法B、目的基因是否转录出mRNA

分子杂交法C、目的基因是否翻译成蛋白质

抗原抗体杂交D、个体生物学水平鉴定PCRSouthernblottingNorthernblottingWesternblotting特性（表型）鉴定鉴定方法