生物学转基因植物

内容提要第一节转基因植物研究进展及应用第二节植物转基因方法第三节植物转基因的筛选及检测第四节转基因植株的安全第一节转基因植物研究进展一、研究进展1、自1984年植物转基因首次在烟草上获得成功以来，植物遗传转化的发展异常迅猛。在短短十几年里，已经有35个科的120多种植物转基因获得成功。2、在全球45个国家中已经完成和正在进行的转基因作物的田间试验已超过25000例，这些试验涉及60种作物的10类经济性状的改造。3、1996年全球转基因植物种植面积不足2000万亩。2001年已近8.0亿亩。近几年每年递增1亿亩。其中美国的转基因植物种植面积接近3/4。主要涉及四大类基因，种植面积及所占比例归纳如下

全球商品化转基因植物的基因类型（面积：百万亩）被转化的基因类型

2000年面积

所占比例（%）

2001年面积所占比例（%）

抗除草剂490.57460977抗虫124.51911715抗虫/抗除草剂487638抗病毒<1.5<1<1.5<1总计6631007891004、2001年种植的7.89亿亩转基因植物中，大豆、玉米、棉花、油菜所占比例分别为63%、19%、13%、5%，转基因大豆、玉米、棉花、油菜的种植面积分别占该作物总种植面积的46%、7%、20%、11%。5、我国转基因植物的研究也在迅速发展，一些转基因植物已达到了商品化，到2008年我国转基因抗虫棉面积已达5700万亩。

我国已商品化的转基因植物名称性能单位年份转基因抗虫棉对鳞翅目害虫抗性达80%Monsanto,中国农科院1996转基因蕃茄常温下可贮藏60—80天华中农大1996转基因矮牵牛观赏北大1996转基因甜椒抗黄瓜叶病毒北大1997转基因蕃茄抗黄瓜叶病毒北大1997转基因番茄

国家863高新生物技术领域中的“利用转基因植物生产乙型肝炎口服疫苗”的研究已取得重大成果，将乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因成功导入西红柿并获得稳定和高效表达，这就意味着，人们不必忍痛，轻松地吃几个西红柿就能拒谈之色变的乙型肝炎于身外。

转基因甜椒

甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。

转基因油菜

油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。

2004年科学家将马铃薯花粉上的一个基因转入玉米，结果使玉米的赖氨酸和蛋白质含量比常规玉米分别提高了30%和90%。转基因玉米

转基因牵牛花

我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。转基因小麦

从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。转基因蓝玫瑰

以色列NeweYaar研究中心的EfraimLewinsohn和同事。他们向西红柿中导入了一种柠檬罗勒基因，该基因能够制造一种香叶醇合酶，从而使西红柿产生类似柠檬的芳香气味。1.目的基因的分离2.载体构建3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA4.对植物组织或细胞进行转化5.植株再生6.转基因植株的鉴定7.转基因植株的种植第二节植物转基因的方法植物转基因的受体系统1．植物组织受体系统：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。缺点：转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

2．原生质体受体系统：是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”，具全能性。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。缺点：遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。

3．生殖细胞受体系统：

以植物生殖细胞花粉细胞为受体细胞进行基因转化的系统。如花粉管导入法。具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。优点：利用植物自身受粉过程，操作方法方便、简单。缺点：转化受到季节的限制，只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。外源基因导入植物的方法（一）DNA直接转移法1.化学刺激法

植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。2.电击法首先是将原生质体在溶液中与DNA混合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，3.显微注射法显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。4.基因枪法克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达。这一方法要使用基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小孔，弹头不能通过。

具体操作是将钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。基因枪法进行遗传转化的步骤：

1、靶细胞或组织的预处理：渗透压调节（甘露醇、山梨醇）

2、质粒DNA的提取与纯化

3、微弹头的制备（质粒DNA浓度、金粉颗粒处理）

4、轰击（距离、压力）

5、抗性愈伤组织的诱导与筛选

6、植株再生与转化体筛选4、花粉管通道法花粉管通道法是将外源DNA涂抹于植物柱头，通过植物授粉，经天然的花粉管通道将外源DNA经珠心进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞，转化率高达10%。

特点：是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品；直接得到转化的种子；受季节限制。

人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化外源基因导入植物的方法1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。农杆菌介导法

（一）农杆菌包括哪两种？农杆菌包括根癌农杆菌（Ti质粒）和发根农杆菌（Ri质粒），质粒中含有一段可移动的DNA称为T-DNA，可作为外源DNA的载体。（二）根癌农杆菌转化植物细胞的过程大致包括：1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识别和附着；2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒上控制T区的基因转移的Vir区基因活化并表达；3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物细胞的核基因组中。农杆菌转化的方法1、共培养法：包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养核愈伤组织共培养。农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略生理状态来源表面有伤口的外植体农杆菌的活化愈伤组织农杆菌的共培养抗性愈伤组织获得及植株再生菌种活化状态培养基成分缩短组培时间提高再生频率农杆菌侵染叶片法流程2、活体接种法：是一种简单易行的方法，转基因的受体为生长健康，无病虫害的个体，选择生长旺盛、细胞分裂快的组织为接种部位，将一定量的对数生长期的农杆菌用针头注射或用锋利刀片切割后涂抹受体的敏感组织，转化组织可以保留在原个体上，也可以切下来离体培养，以获得较高的转化效率。2N6诱导愈伤7-10dN6-BA预培养2-3d种子优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系AB-AS诱导12hAB培养基活化12hYEP平板单菌落液体MS浸泡15min无生长素N6-AS共培养3dN6-H选择培养20d抗性愈伤组织的获得及植株再生30d62d~70d1

2N6愈伤诱导2N6-BA预培养3N6-H选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程4植株再生农杆菌转化法的特点

1、受体类型广泛，可以是原生质、单细胞、细胞团、组织、器官和植株水平；2、简单易行、周期短、转化效率较高3、转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以筛选、淘汰未转化细胞；4、影响转化效率的因素相对较少，受体再生系统、细菌株系是其中的两个重要因素。

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第三节植物转基因的筛选及检测

基因转化后的第一步工作是筛选转化细胞。在含有选择压力的培养基上诱导转化细胞分化，形成转化芽，再诱导芽生长、生根，形成转化植株。第二步是对转化植株进行分子生物学鉴定。第三步则是进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究。一、抗性基因

一般用抗性基因来富集转化细胞。抗性基因应满足以下几点：

1.抗性基因应是显性基因。

2.在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集。

3.抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或发育有抑制作用。

4.选择物价廉易得。1.抗生素抗性基因1.npt新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、巴龙霉素、新霉素具有抗性。2.aphIV

潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性。3.spt

链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性。4.cat

氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗生素活性。等等。Fig.5Kanamycintreatedtransgenic,resistant(green)andnon-transgenic(white)seedlings.

2.抗除草剂基因除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培养抗除草剂的作物。抗除草剂基因主要有bar和pat基因以及抗草甘膦的epsps基因。二、显色或发光报告基因1.GUS酶活性检测

gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷酶该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的Gus活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因。此外，gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有Gus活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。主要有一下三种检测方法：（1）组织化学染色定位法该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化，表达出GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，此靛蓝染料使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。Fig.1TransgeniccallishowingGUSexpression.

TransgenicrosesomaticembryoTransgenicappleshoot1.PCR技术检测是根据转基因植物中外源基因的特点，设计并合成相应的引物，以转基因植物DNA为模板进行PCR扩增反应。如PCR扩增反应的产物与外源基因片段相同，表明该植物为转基因植物。

PCR检测DNA用量少，操作简单，快速灵敏，不需用同位素即可完成。应用PCR检测易出现假阳性，可用PCR－Southern杂交进一步验证。三、分子生物学检测方法2.分子杂交检测

Southern杂交：验证转化基因是否存在于转化体中，基因的拷贝数，但不能得到基因表达的信息，只有通过mRNA和蛋白质的检测以及表现型的鉴定。利用探针与其互补的核苷酸序列杂交后，就可以从诸多的核苷酸序列中检测出与其互补的序列。

Northern杂交：检测基因在转录水平上的表达，用以检测外源基因表达出来的mRNA。生物学检测Fig.6Resistant(left)andsusceptible(right)plantsoftriticaleafterherbicideBastasprying.1.转基因植物释放引发“超级杂草”目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。第四节转基因植株的安全

第一种是转基因植物腐烂后DNA残留被近源植物、微生物所捕获，而具有了某种特性（转基因特性）。

第二种途径：转基因植物花粉的飘飞。

超级杂草DNA释放田间抗除草剂转基因植株腐烂非转基因植物捕获

加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说，小麦由Ａ、Ｂ、Ｄ三个基因组组成，它是由分别带有Ａ、Ｂ、Ｄ基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。2.转基因植物中35S启动子的生物安全性启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等。潜在风险问题:35S启动子内有一重组热点。（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。3.抗生素抗性标记基因的生物安全性目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。抗性标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性（食品安全性）。

标记基因的传染：载体上，通常有一段或多段标记基因。粪便中分离的变异菌株转基因番茄抗性基因4.转基因食品的安全性1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市，成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。转基因食品对人类的可能危害主要有3大类：（1）可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。（3）食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。食品过敏：过敏是免疫系统对特殊蛋白产生的一种反应。转基因食品中含有新基因所表达的新蛋白，有些可能是致敏原，有些蛋白质在胃肠内消化后的片段也可能有致敏性。过敏反应过敏原进入体内转基因产品Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。

英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。

5.抗虫、抗病和抗除草剂类转基因植物，除对害虫产生毒害而使其死亡外，对环境中的许多