巴特火麻仁木脂素酰胺类粗提物的分离鉴定及活性清除作用研究

巴特火麻仁木脂素酰胺类粗提物的分离鉴定及活性清除作用研究

生物能量代谢将氧气作为氧气代谢过程中的电子接受体，不可避免地产生氧自由基（ros）。根据相关研究，自由基氧化损伤与衰老、疾病和人类免疫缺陷（hiv）感染之间存在着密切的关系[1.3]。因此，自由基分离剂逐渐成为研究的热点。巴马火麻仁源自于世界著名第五大长寿之乡——广西巴马,为桑科植物大麻CannabissativaL.的干燥成熟果实.目前,对火麻仁药理作用的研究主要是火麻仁油的抗氧化活性,而对其木脂素酰胺类(lignanamidesofFructusCannabis,LFC)的药理活性研究较少,其抗氧化活性的相关研究在国内外均未见报道,因此本文通过研究LFC体外清除自由基活性,以期筛选能阻断氧自由基反应的天然、高效的抗氧化活性物质,为火麻仁进一步的开发利用提供可靠的科学依据.1实验部分1.1桑科植物治疗水生动物的研究AL204电子微量分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);Cary50紫外可见分光光度计(美国瓦里安中国有限公司);火麻仁(广西省巴马县,为当年收获,经中国人民解放军第302医院中医药研究所肖小河研究员鉴定为桑科植物大麻CannabissativaL.的干燥成熟果实);抗超氧阴离子自由基试剂盒、抗羟自由基试剂盒(批号20080624,南京建成生物工程研究所);D101大孔树脂(河北沧州宝恩化工有限公司);柱层析用硅胶(200~300目,青岛市海洋试剂厂);DPPH(美国Sigma公司);其余试剂均为分析纯.1.2乙酸乙酯萃取物上柱层析将粉碎的火麻仁粉末10kg,用10倍70%的乙醇溶剂提取2次,每次1.5h,减压浓缩,用乙酸乙酯萃取所得的乙酸乙酯萃取物上柱层析用硅胶(200~300目)以氯仿-甲醇(85∶15)洗脱,并用SephadexLH20纯化后反复用甲醇重结晶,得白色粉末.1.3粗提物的提取火麻仁粉碎后经石油醚脱脂,用8倍70%的乙醇溶剂提取2次,每次1.5h,抽滤,得到粗提物.将滤液减压回收至密度为1.05~1.10,采用低醇上样,上D101大孔树脂,用60%的乙醇洗脱得到精提物(纯度57.95%).1.4总木脂素酰胺含量测定以cannabisinA为对照品(归一化法测定其含量为98.3%),用改进的Folin-酚法测总木脂素酰胺的含量.1.5对dpph的清除作用精密称取20mgDPPH·,用无水乙醇溶解并定容于250mL量瓶中,DPPH·的浓度为20mmol/L,冰箱避光保存.按表1加样于具塞试管中,充分混匀,室温静置30min,以无水乙醇做空白,在517nm波长处测定其吸光度.根据下列公式计算测定液对DPPH·的清除率(P):P=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%.1.6o-pla-1,2-o--pla采用超氧阴离子自由基测试盒,模拟人体黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系,产生超氧阴离子自由基(O2-).反应如下:按照测试盒说明进行加样,充分混匀,于37℃恒温水浴40min,加入2mL显色剂,混匀后静置10min,用蒸馏水调零,测定550nm波长处的吸光度A550.待测液对2O-的抑制率=(对照管A550-测定管A550)/对照管A550×100%.1.7抑制率测定采用羟自由基试剂盒,以经典的Fenton反应体系产生OH·,反应如下:按照测试盒说明进行加样,混匀后于37℃反应l.0min.再分别加入2mL显色剂,室温放置20min,用蒸馏水调零,测定550nm波长处的吸光度A550.待测液对OH·的抑制率=(对照管A550-测定管A550)/对照管A550×100%.1.8处理数据实验结果以均数±标准差示结果,采用Origin7.5的曲线拟合工具计算样品清除自由基的半数有效剂量值EC50.2结果与讨论2.1离子检测FAB-MS(m/z):595[M+H]+,表明分子量为594,主要碎片离子峰为458.2,186.2.该化合物1HNMR(DMSO,500MHz)和13CNMR(DMSO,125MHz)数据与文献中的数据基本一致,故鉴定该化合物为cannabisinA.2.2dpph的清除活性由于DPPH·苯环的共轭和位阻及硝基的吸电子作用使夹在中间的氮原子上的不成对电子不能发挥电子成对作用,因此DPPH·是一种稳定的自由基.在无水乙醇溶液呈深紫色,且在517nm处有一强吸收峰.当自由基清除剂存在时,DPPH·与其给出的氢相结合,反应体系的颜色不断变浅,其褪色程度与接受的电子数成定量关系.粗提物、精提物及cannabisinA对DPPH·的清除能力见图2及表2.由图可知,三者均具有明显的清除DPPH·的活性并与剂量呈一定的量效关系,精提物、cannabisinA清除DPPH·的活性略高于粗提物.在7.61~12.9µg/mL范围内三者清除DPPH·的速率增长得最快;当浓度达到22.7µg/mL时,粗提物、精提物及cannabisinA对DPPH·的清除率达到最大值,分别为74.77%,90.31%,85.77%.2.3o2-的清除能力O2-是生物体内最早生成的一种自由基,能反应生成其它自由基,如H2O2,OH·等.粗提物、精提物及cannabisinA对O2-的清除能力见图3及表2.可知,在所选剂量范围内,三者具有一定的清除O2-的活性并与剂量呈明显的量效关系.CannabisinA对O2-的清除活性明显低于粗提物、精提物,而粗提物清除O2-的活性略低于精提物.CannabisinA在剂量为0.69mg/mL时清除率达到最大值85.79%,而粗提物、精提物在0.46mg/mL就分别达到86.79%,91.10%.2.4粗提物、精提物及cannabisina的体外抗氧化活性评价生物体内的O2-在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下还原生成H2O2,H2O2再与O2-作用进一步通过Haber-Weiss反应生成OH·.OH·是目前所知活性最强、对生物体内毒性最大的一种自由基,因此清除OH·的活性成为评价抗氧化活性的重要指标.由图4可知,在所选剂量范围内,三者具有明显清除OH·的活性并与剂量呈量效关系,但精提物及cannabisinA清除OH·的活性远远高于粗提物,粗提物、精提物及cannabisinA的EC50分别为105.1,8.424,16.80µg/mL(表2),精提物及cannabisinA清除OH·的活性几乎分别是粗提物的13倍、6.5倍.O2-及OH·是生物体内最重要的两种氧自由基,它们对体内生物大分子的攻击,往往可引起其他重要自由基的生成(如脂过氧自由基ROO·).LFC属于多酚类物质(Polyphenols),由于其苯环上酚羟基的供氢作用,将H·供给R·,OH·等活性自由基,自身在邻位羟基或甲氧基的影响下能形成相对稳定的酚氧自由基A·,可以终止自由基的链锁反应,因此具有一定的抗氧化作用,其活性大小主要取决于酚羟基的数目与位置.反应机理如下:本文对粗提物、精提物及cannabisinA进行了体外清除DPPH·,O2-及OH·的活性评价,发现精提物对以上三种自由基的清除能力最强,表明LFC可能是火麻仁的主要活性成分,经大孔树脂富集后纯度更高;而cannabisinA活性清除作用之所以低于精提物,可能是精提物中共存的木脂素酰胺类成分产生了协同效应从而增强了抗氧化活性;与粗提物的清除活性相比,cannabisinA清除DPPH·,OH·的活性较强,而清除O2-的活性较弱,其原因有待于进一