四棱豆叶片凝集素提取及其凝集活性研究

四棱豆叶片凝集素提取及其凝集活性研究

野生四角豆（l.）又称三叶豆、翅膀豆和四方豆，属于科氏科。它是一种一级或二级植物。亚洲热带地区，云南、广东、海南等地都可以种植。四棱豆的种子、块根、嫩荚、嫩叶均含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质,具有较高的营养价值。凝集素是一种非免疫源性的蛋白质或糖蛋白,能与细胞表面的糖残基进行可逆的特异性结合,可促使动物血细胞、淋巴细胞、精子等细胞产生凝集作用[3~5]。四棱豆含有具有凝血作用的低分子量植物性糖蛋白凝集素。迄今,四棱豆凝集素的提取纯化工作主要集中于种子和块根,应用研究(如昆虫抗生作用)取得了一些进展[7~8]。由于四棱豆嫩叶和嫩豆荚是主要食用部分,从食品安全角度,需要加强对叶中凝集素活性研究。笔者采用正交表对四棱豆叶凝集素提取方法及其凝集活性进行研究,为制定四棱豆的安全加工方法提供依据。1材料和方法1.1斯亮蓝g-400缓冲液ps/l四棱豆(品种为顺强198)市售;新鲜鸡血;牛血清蛋白;考马斯亮蓝G-250;PBS缓冲液(浓度为0.102mol/L,pH7.2);抗凝剂(0.1mol/L柠檬酸钠溶液);氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂均为分析纯。1.2xyj80-2电动离心机构METLERAE240型电子分析天平;XYJ80-2电动离心机;Lentrifuge5415D台式高速离心机;KJ1012B科进超声波清洗仪;722分光光度计。1.3方法1.3.1离心液的制备新鲜叶自来水清洗后,用75%酒精漂洗,蒸馏水洗2次,研成匀浆,按一定的料液比(m/V)加入氯化钠提取剂,混匀后冰箱内4℃提取,分别3000r/min离心15min、10000r/min离心5min,上清液为待测液,置4℃冰箱保存。1.3.2内联活性测定1.3.2.抗凝剂v抗凝剂鸡红细胞悬液配制参见文献(有修改)。取新鲜鸡血,加入抗凝剂[V(血):V(抗凝剂)=1:1]置4℃冰箱保存。加0.9%氯化钠溶液,1500r/min下离心5min,重复洗涤4~5次,直至上清液透明,去上清,红细胞加入PBS缓冲液配制成5%(V/V)红细胞悬液,置4℃冰箱暂存。1.3.2.扩大2.5%红细胞悬液2l的测定取10支干净试管,各试管加入PBS缓冲液50μL;第1试管为对照;于第2试管加待测液50μL,摇匀吸出50μL转入第3试管,以此类推作倍比稀释至第10试管,从第10试管取50μL弃去;再向各试管加入5%红细胞悬液50μL,混匀。在室温(约30℃)条件下放置1~2h后观察,判定红细胞凝集效价(以2i表示凝集效价),红细胞凝集分类标准参见文献。1.3.2.glutintingaclita凝集活性aa通过对凝集效价定性数据赋值,其加权平均数作为量化凝集活性(agglutinatingactivity,Aa)。根据凝集效价赋值如表1。则,凝集活性(Aa)量化公式如下:式中:A为待测液凝集反应赋值;Wi为凝集活性权重,Wi=2-i;n为倍比稀释次数。1.3.3标准曲线的绘制以不同系列浓度(1~50μg/mL)标准牛血清蛋白溶液,加入考马斯亮蓝染色,于分光光度计620nm出测定吸光度,得标准曲线y=0.005x+0.1631(R2=0.9659)。取鲜叶0.5g研磨,加20mmol/LKH2PO4提取,4000r/min离心,上清液按标准曲线步骤测定吸光度,计算质量浓度(%)。1.3.4凝集素的提取条件选取氯化钠浓度、提取时间、料液比三个因素,以蛋白质含量为指标,做L9(34)正交试验,并进行方差分析,优化凝集素的提取条件,正交因素水平表见表2,正交实验结果见表3,方差分析见表4。2结果与分析2.1单因素试验结果由表3可知,各试验组合提取液的凝集效价均在23以上,对照呈阴性,无凝集活性。各试验组合中,2号试验提取液在26仍有血凝效果,3、4、7号试验提取液在25有血凝效果,6号在23有血凝效果。从凝集活性(Aa)可以看出,各试验组合的Aa值在0.325~0.469之间。其中,3号试验提取液凝集活性最高,6号最低。由于相同倍数稀释液的血凝效果存在差异,导致凝集活性与凝集效价出现不同结果,但各试验组合中血凝效果总体规律一致。显然,凝集活性Aa值更有利于对不同试验血凝效果比较。由表3和表4可知,对蛋白质含量来说,料液比对四棱豆叶蛋白质含量影响显著,1:30处理对蛋白质含量的影响均最大,氯化钠浓度、提取时间2个因素的影响不显著;对提取液凝集活性来说,氯化钠浓度、提取时间、料液比3个因素对各试验提取液凝集活性的影响均未达到显著水平,其中,0.9%氯化钠浓度、提取16h、料液比1:30处理对凝集活性的影响较大。2.3蛋白质含量对凝集活性的影响对表3中的蛋白质含量与凝集活性作图,见图1。由图1可以看出,各提取液的蛋白质含量与凝集活性之间呈极显著的正相关(r=0.769,P=0.008):四棱豆叶提取液的蛋白质含量增加,凝集活性也随着升高。孙东等研究表明蛋白质含量与凝集素含量之间具有相关性,因此四棱豆叶提取液蛋白质含量与其凝集素含量呈正相关。2.4凝集活性及蛋白质含量分别称取0.5g四棱豆叶、豆荚和种子(均为鲜重),研磨后按一定的料液比(1:30)加入0.9%氯化钠溶液,4℃提取24h,各提取液的凝集活性及蛋白质含量见表5。种子中蛋白质含量、凝集活性均最高,豆荚次之,叶最低。有研究资料表明,四棱豆叶中凝集素活性低于块茎和种子,本实验中叶和豆荚的凝集活性Aa值分别为0.469和0.497,表明四棱豆叶、豆荚中凝集素毒性不可忽视。3凝集效价加权个数方法的应用在血凝试验中,相同倍比稀释液的血凝效果常存在差异,导致不同凝集素提取液的凝集效价确定困难问题。于敏等使用血凝细胞烘干称重法测定凝集素相对含量,该方法受植物凝集素提取液中杂质的影响较大。李笑梅考察了离心转数对血凝细胞干重的影响,认为3000r/min离心可以解决较小血凝细胞颗粒不能完全沉降问题。植物凝集素的血凝反应除受自身性质和血细胞表面结构影响外,还受提取液pH、浓度、碎片等杂质的影响。因此,笔者认为直接使用凝集效价加权平均数方法对血凝效果进行量化,数值在0~1之间,便于对不同试验血凝效果进行定量比较。本实验中的不同凝集素提取液的凝集效价与凝集活性Aa值的变化规律基本一致。与凝集效价指标相比,凝集效价加权平均数方法得出的凝集活性Aa值更简捷、有效。正交试验结果表明四棱豆叶中蛋白提取对氯化钠浓度、提取时间要求不高,料液比1:30处理对蛋白质提取效果最好。由于蛋白质含量与凝集活性之间具有显著相关性,提取四棱豆叶凝集素时需参考蛋白质提取因素和水平的影响。四棱