葡萄汁中可同化氮素对葡萄酒发酵的影响

葡萄汁中可同化氮素对葡萄酒发酵的影响

0葡萄汁可同化氮素的添加量葡萄酒的味道成分是葡萄酒质量的重要组成部分。根据工艺过程和来源，葡萄酒香、发酵香和陈戈香分为品种香、发酵香和香料。发酵香气是在葡萄酒酒精发酵过程中产生的香气,主要构成物质为高级醇、酯类、挥发性脂肪酸、羰基化合物及挥发性硫化合物等。影响葡萄酒发酵香气最基本的因素是发酵原料、酵母种类和发酵条件。葡萄汁中的氮化物影响酵母的生长、发酵速率、发酵持续时间及糖代谢速率等。在酒精发酵过程中,酵母优先利用的氮源为铵态氮、游离α-氨基酸(脯氨酸除外)和小分子多肽,被称为酵母可同化氮素(yeast-assimilablenitrogen,YAN)。铵态氮是酵母可同化氮素的主要成分,是酿酒酵母优先利用的无机氮源;而葡萄汁中的游离氨基酸是葡萄酒发酵香气成分的主要前体物,其含量直接影响葡萄酒中高级醇、酯类及挥发性脂肪酸等香气成分的形成。葡萄汁可同化氮素的组成及含量与品种、砧木、生态条件、施肥、土壤管理、果实成熟度等密切相关[12,16,17,18,19,20,21]。较多的研究认为,葡萄酒正常发酵所需的最低可同化氮素含量为140—150mgN·L-1,适宜发酵需要的可同化氮素为200—500mgN·L-1,超过500mgN·L-1则认为可同化氮素含量过量。实际上,发酵所需的可同化氮素浓度与酵母菌株、葡萄汁含糖量、发酵条件等密切相关。葡萄汁中可同化氮素含量过低(小于140mgN·L-1)会导致发酵过程中酵母菌数量低,发酵活力弱,增加葡萄酒发酵延缓和中止的危险性;生产上为了避免和解决这一问题,通常在发酵前和发酵早期向葡萄汁中添加可同化氮素如铵盐、氨基酸等;但可同化氮素添加过量会导致生物胺和致癌物质氨基甲酸乙酯的产生。国外关于葡萄汁可同化氮素的添加对酒精发酵动力学、葡萄酒香气成分及葡萄酒的质量等方面进行了很多研究[12,13,14,15,16,17,24,25,26,27,28,29,30],如Vilanova等与Torrea等研究认为,高级醇、支链脂肪酸、支链脂肪酸乙酯含量随葡萄汁中可同化氮素含量增加而减少,而中链脂肪酸和中链脂肪酸酯随可同化氮素含量增加而增加。目前国内有关可同化氮素与酵母生长、发酵动力和发酵香气物质的研究很少,张瑾等研究表明,模拟葡萄汁中可同化氮素含量增加,酵母菌数量增加,发酵速率加快,高级醇和酯类含量升高。因此,葡萄汁中可同化氮素的含量及葡萄酒酿造过程中可同化氮素的合理添加,对于提高葡萄酒发酵过程中优良香气物质的产生,减少不良香气,进一步提高葡萄酒的感官质量具有重要的意义。作者在本课题组研究酿酒葡萄果实氮化物的基础上,结合前人研究成果,综述了葡萄汁可同化氮素对葡萄酒发酵香气物质的影响。1酒精发酵过程高级醇、酯类、挥发性脂肪酸及挥发性硫化合物是葡萄酒发酵香气的重要组成成分。高级醇主要是由酵母菌酒精发酵过程中氨基酸和糖代谢中间产物α-酮酸形成;酯类物质包括脂肪酸乙酯和乙酸酯,分别由酰基CoA与乙醇和高级醇合成;挥发性脂肪酸是高级脂肪酸裂解或醇、醛氧化的产物;挥发性硫化合物主要是半胱氨酸和甲硫氨酸代谢过程的产物;发酵香气物质的合成途径见图1。1.1高级醇及氨基类化合物所有酵母发酵过程中都会产生一定量的高级醇,目前已从葡萄酒中检测到100余种高级醇类物质。除乙醇外,高级醇约占葡萄酒香气成分的50%,对葡萄酒香气有重要影响,其含量低于300mg·L-1时,可增加葡萄酒香气的复杂性,但其含量超过300mg·L-1时,则会破坏葡萄酒的香气。发酵过程中形成的高级醇主要有1-丙醇(清爽,酒精味)、1-丁醇(酒精味)、2-甲基-1-丙醇(苦杏仁味)、2-甲基-1-丁醇(药物化学味)、3-甲基-1-丁醇(奶酪味)、异丁醇(杂醇油的醇香)、异戊醇(苦杏仁味、涩味)、1-己醇(青菜味、吐司味)、苯甲醇(苦杏仁味)和2-苯乙醇(玫瑰花香、蔷薇香气、花粉味)等。大多数高级醇是酵母发酵的副产物,由氨基酸衍生的α-酮酸形成,或由葡萄糖代谢过程中间产物α-酮酸形成,如图2所示。可同化氮素含量较低会导致酵母菌发酵活力减弱,使葡萄糖代谢中间产物α-酮酸过剩,大量酮酸脱羧还原形成高级醇;反之,可同化氮素含量高会减少高级醇产生。许多研究表明,高级醇含量与起始可同化氮素含量成反比,尤其是在低氮含量下。Torrea等发现向霞多丽葡萄汁中添加铵和氨基酸,当可同化氮素含量在200—500mgN·L-1时,2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇和2-苯乙醇等所有高级醇随可同化氮素含量增加而减少;当可同化氮素含量低于300mgN·L-1时,高级醇含量高于300mg·L-1,破坏了葡萄酒的香气。同时Losada等及Hernández-orte等研究发现向葡萄汁中添加铵盐或氨基酸,异戊醇和苯甲醇等含量随可同化氮素浓度增加而显著减少。因此,添加铵或氨基酸使葡萄汁可同化氮素含量增加,高级醇含量减少,杂醇油等不愉快气味减少,可提高葡萄酒的香气质量。但是也有研究表明,葡萄汁中添加支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸反而会增加异戊醇、异丁醇和苯乙醇的含量。Lilly等发现向葡萄汁中添加缬氨酸可增加葡萄酒异丁醇的含量,添加亮氨酸和异亮氨酸可增加异戊醇含量,其中添加亮氨酸还可间接增加2-苯乙醇含量。Hernández-orte等研究发现,苯丙氨酸含量与2-苯乙醇产生量成正比关系,葡萄汁中苯丙氨酸含量增加,2-苯乙醇含量会显著增加。1.2其他葡萄汁添加的化学成分葡萄酒中含有有机酸和醇类,有机酸和醇可以发生酯化反应,生成各种酯类化合物,发酵过程中产生的酯类主要有脂肪酸乙酯和乙酸酯,在酯酶催化作用下酰基CoA与乙醇合成形成脂肪酸乙酯,乙酰CoA与高级醇合成乙酸酯,它们能赋予葡萄酒果香和花香,对葡萄酒香气质量有重要贡献。发酵过程中产生的酯类主要有:乙酸乙酯(果香、酯香)、丁酸乙酯(酸果香、草莓香)、己酸乙酯(青苹果味、草莓香、茴香味)、辛酸乙酯(果香、茴香味)、葵酸乙酯(脂肪味、果香、舒适的醋味)、乙酸己酯(梨味)、乙酸异戊酯(香蕉味)、乙酸-2-苯乙酯(舒适的花香);此外还有一些支链脂肪酸乙酯,如异丁酸乙酯(果香、草莓味)和异戊酸乙酯(香蕉味、甜果香)等。葡萄酒中,中链脂肪酸乙酯和乙酸酯含量一般随葡萄汁中可同化氮素含量的增加而增加,而支链脂肪酸乙酯含量随可同化氮素含量增加而减少。Mendes-Ferreira等向可同化氮素含量缺乏的葡萄汁中添加磷酸氢二铵使可同化氮素含量达到200—500mgN·L-1,发现葡萄酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等中链脂肪酸乙酯以及乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯含量随可同化氮素增加而显著增高,但丁二酸二乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯和2-甲基己酸乙酯等支链脂肪酸乙酯含量随可同化氮素含量增加而减少。Garde-Cerdan和AncínAzpilicueta研究发现,向Mazuelo葡萄汁中添加45—250mgN·L-1可同化氮素,发现酯类总含量、乙酸异戊酯和乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯含量与添加的可同化氮素含量成正比关系;而丁二酸二乙酯和3-羟基丁酸乙酯等支链脂肪酸乙酯含量则与添加的可同化氮素含量成反比关系。因此,随葡萄汁可同化氮素含量在140—500mgN·L-1内增加,丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等中链脂肪酸乙酯及乙酸酯含量增加,葡萄酒的果香和花香增加。1.3添加量对葡萄酒脂肪酸含量的影响挥发性脂肪酸是高级脂肪酸裂解或醇、醛氧化的产物,葡萄酒中常见的挥发性脂肪酸有乙酸(醋味)、丙酸(羊腥味)、丁酸(变质奶酪味)、异丁酸(脂肪味)、戊酸(不愉快化学味)、异戊酸(腐败味)、己酸(猫尿味、汗臭味)、辛酸(奶酪味、腐败味、涩味)和葵酸(不愉快脂肪味)等。虽然丁酸、己酸、辛酸和葵酸具有不愉快气味,但它们形成的乙酯,与品种香气协调性良好,是葡萄酒香气质量的重要保证。许多研究表明,在可同化氮素低于150mgN·L-1的葡萄汁中添加磷酸氢二铵、硫酸铵或氨基酸至同化氮素含量在200—500mgN·L-1时,随着可同化氮素添加量的增加,2-甲基丙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸、异丁酸和异戊酸等支链酸含量随可同化氮素含量的增加而减少,而己酸、辛酸和葵酸等中链脂肪酸随可同化氮素含量增加而增加。说明葡萄汁中等或较高含量的可同化氮素含量使葡萄酒2-甲基丙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、异丁酸和异戊酸等支链酸含量减少,腐败味及不愉快脂肪味减少,香气质量提高;同时己酸、辛酸和葵酸等中链脂肪酸含量增加,会促进相应的乙酯形成,增加葡萄酒的果香和花香。乙酸是葡萄酒中含量最高的脂肪酸,国标规定其含量不能超过1.2g·L-1。葡萄汁可同化氮素含量中等时,乙酸产生量低,但含量过高,会导致乙酸含量增加,破坏香气质量。目前乙酸形成机理与可同化氮素之间关系研究的最透彻,Bely等发现可同化氮素对葡萄酒乙酸产生影响的原因是可同化氮素影响酵母的生长速率和细胞数量,酵母数量变化影响细胞内外的渗透压,为了维持渗透压,需要产生NADH,抑制了乙醛还原为乙醇,而促进了乙醛氧化为乙酸。Barbosa等研究表明,在葡萄汁可同化氮素含量低于400mgN·L-1时,葡萄酒的乙酸含量较低,而可同化氮素含量高于400mgN·L-1时,乙酸含量明显增高。Vilanova等发现葡萄汁中可同化氮含量为200—300mgN·L-1时,乙酸含量较低,为0.3—0.4g·L-1,而可同化氮素含量为500mgN·L-1时,乙酸产生量最高,为1.2g·L-1。因此,葡萄汁中可同化氮素含量过高时,可能会导致乙酸含量超标,影响葡萄酒的质量。1.4葡萄汁添加量随添加氮素的变化葡萄酒中挥发性硫化合物分为两类:高挥发性硫化合物(沸点<90℃)和低挥发性硫化合物(沸点>90℃),高挥发性硫化合物主要为H2S、乙硫醇和甲硫醇等,这些高挥发性硫化合物不易清除,且在低浓度下也具有不良香气,对葡萄酒品质有极大危害。H2S具有不愉快的“臭鸡蛋”味,主要由酵母中无机硫化合物、硫酸盐、亚硫酸盐或有机硫化合物半胱氨酸、谷胱甘肽代谢产生。如图3所示,当葡萄汁中缺乏有机硫化合物,酵母主要利用无机硫化合物合成有机硫化合物,H2S是代谢中间产物,这一过程需要适宜的氮供应,如果可同化氮素供应不足,游离H2S在酵母细胞中累积,然后扩散到发酵的葡萄汁中。Marks等研究发现,可同化氮素是调控酒精发酵阶段H2S产生的重要因素。Ugliano等向可同化氮素低于140mgN·L-1的霞多丽葡萄汁中添加铵盐至可同化氮素含量为200—500mgN·L-1时,H2S含量随可同化氮素含量增加而减少。其它高挥发性硫醇如甲硫醇和乙硫醇,分别赋予葡萄酒臭鸡蛋和洋葱味,其含量同样随葡萄汁可同化氮素含量增加而降低。Hernández-orte等研究发现甲硫醇含量随葡萄汁中可同化氮素含量增加而减少,可同化氮素含量为100mgN·L-1产生的甲硫醇含量是可同化氮素含量为300mgN·L-1时的3倍。因此,葡萄汁可同化氮素含量低于140mgN·L-1时,高挥发性硫化合物含量多,使葡萄酒具有令人不愉快的臭味;随着可同化氮素在200—500mgN·L-1增加,高挥发性硫化合物含量降低,葡萄酒香气质量提高。另有研究发现,葡萄汁可同化氮素对H2S的影响受酵母菌株、泛酸和生物素等因素的影响。Mendes-Ferreira等发现对酿酒菌株UCD522和PYCC4072而言,H2S含量随葡萄汁可同化氮素含量增加而减少。Wang等发现当葡萄汁泛酸含量缺少时,可同化氮素含量增加,H2S产生量反而增加,而当泛酸含量充足时,可同化氮素含量增加,H2S含量下降。Bohlscheid等发现生物素含量过低和过高时,可同化氮素含量增加,H2S含量会有所增加。2药物组分对葡萄酒感官评价的影响在酒精发酵过程中,糖代谢产生多种挥发性成分,包括高级醇、脂肪酸、酯类、羰基化合物、硫化物和有机酸等,构成葡萄酒香气和滋味成分。可同化氮素对这些化合物的形成有重要的贡献,尤其是高级醇和酯类;另外,也影响其它挥发性成分如H2S、硫醇和挥发性脂肪酸的形成。因此,可同化氮素的组成和含量对葡萄酒的成分及感官质量有重要的影响。通常认为含有高含量酯类和低含量高级醇的葡萄酒具有较高的感官评价,葡萄汁可同化氮素含量影响高级醇和酯类的产生,从而影响其葡萄酒感官评价。当葡萄汁可同化氮素为低氮水平时,发酵过程中高级醇产生量较高而酯类产生量较少,感官质量差;而葡萄汁可同化氮素为中等水平或高水平时,发酵过程产生的高级醇含量减少,而具有果香和花香的酯类含量增高,感官质量较高。Hernández-orte等发现发酵前向葡萄汁中添加可同化氮素能改善葡萄酒的感官质量,使不良气味如硫味和还原味减少,而花香和植物香增加。Torrea等发现可同化氮素含量低的葡萄汁酿造的葡萄酒果香和花香产生量低;中等可同化氮素水平酿造的葡萄酒其优良香气和不良香气达到平衡,香气质量好;而高可同化氮素水平酿造的葡萄酒能产生果香和花香,同时也产生酸味和溶剂味,降低了葡萄酒整体感官质量。3葡萄汁促进酯化反应的基因表达目前,酒精发酵过程中与酿酒酵母氮代谢有关的基因主要有GAP1(氨基酸通透酶表达基因)、MEP2(铵通透酶表达基因)、CAN1(精氨酸通透酶表达基因)、GAD1(谷氨酸代谢)、GDH1(谷氨酸脱氢酶表达基因)、BAT1和BAT2(侧链氨基酸转氨酶表达基因)、ATF1和ATF2(醇酰基转移酶表达基因)以及ALD基因(醛脱氢酶表达基因)。其中BAT、ATF、ALD基因直接参与酒精发酵过程中发酵香气物质的产生,BAT直接参与高级醇的形成,ATF调控乙酯产生,ALD参与挥发性脂肪酸的形成,它们都与葡萄汁可同化氮素含量有显著的关系。BAT1和BAT2基因调控侧链氨基酸转氨酶催化氨基酸转变成高级醇生物合成的前体物质α-酮酸,从而影响高级醇的含量。Yoshimoto等研究发现氨基酸生物合成基因(BAT1、BAT2)在低可同化氮素水平下表达增加,而在高可同化氮素水平下表达受抑制。Lilly等研究表明BAT基因表达量增加使葡萄酒异戊醇、异丁醇含量升高,乙酸、辛酸和葵酸等中链脂肪酸的形成与BAT1和BAT2的表达没有显著的关系,而BAT基因的过量表达能减少乙偶胭(异丁醇和异戊醇前体物质)和乙酸乙酯的含量。ATF1和ATF2基因调控醇酰基转移酶促进乙酯生物合成。Yoshimoto等研究发现增加可同化氮素利用率能提高ATF1和ATF2基因的表达水平,促进乙酯的形成。Laere等发现ATF基因表达量增加能提高乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等酯类的产生。ALD4、ALD5基因编码线粒体醛脱氢酶,ALD2、ALD3和ALD6基因编码细胞质醛脱氢酶,ALD4和ALD6能调控乙醛合成乙酸。Marks发现向雷司令葡萄汁中添加可同化氮素能抑制ALD2、ALD4和ALD5基因的表达,但不影响ALD6基因表达,ALD4基因表达受抑制会减少乙酸的含量。可见,葡萄汁可同化氮素水平与酿酒酵母氮代谢相关基因的表达及发酵香气成分具有密切的关系。因此,进一步深入研究酒精发酵