宇佐美曲霉aus-amii-cf1固体发酵培养基的优化

宇佐美曲霉aus-amii-cf1固体发酵培养基的优化

中国是一个拥有大量水果的大国，每年都会生产大量水果的副产品。柑橘皮富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种矿物质元素，是一种良好的微生物生长基质。目前，对柑橘皮的研究主要集中在内含成分的提取，对利用微生物发酵柑橘皮生产酶制剂的报道较少。吴厚玖等（1997）开展了柑橘皮渣发酵饲料中间试验研究，Ismail（1996）对微生物液体发酵柑橘皮产酶进行研究。用柑橘皮为原料，固体发酵生产复合酶制剂的方法在国内外未见报道。我们的试验旨在研究酶系较全、产酶水平较高的宇佐美曲霉A.usamii-CF1利用柑橘皮进行固体发酵产酶的最佳条件。1材料和方法1.1固体基础发酵培养基菌种:实验室选育菌株A.usamii-CF1。斜面培养基（PDA培养基）：20%土豆汁、2%葡萄糖、1.8%琼脂,自然pH值。固体基础发酵培养基（简称基础培养基）：干燥橘皮粉4g、豆粕1g、尿素0.1g、水10ml，自然pH值。试剂:DNS试剂、0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值4.8）、0.1M乳酸-乳酸钠缓冲液（pH值为3.0）、福林试剂(Folin试剂)、0.4M碳酸钠溶液、0.4M三氯乙酸溶液、2%酪蛋白溶液（pH值为3.0）、100μg/ml酪氨酸溶液。1.2方法1.2.1发酵温度对各种酶的影响在250ml三角瓶中，装入固体发酵培养基，搅拌均匀，121℃灭菌20min，冷却后接入由斜面培养基培养后制成的浓度为107个/ml的孢子悬浮液1ml，置于28℃生化培养箱中发酵培养60h，测定各种酶的酶活。1.2.2酶提取酶取一定量的发酵固体，加入10倍发酵固体量的蒸馏水，间歇搅拌1.5h，一层滤纸过滤得粗酶液，用蒸馏水稀释后作酶测定用。1.2.3蛋白酶活力测定纤维素酶[羧甲基纤维素（CMC）酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶（FPA）]测定采用DNS法。酶活定义为：在pH值为4.8，温度为50℃条件下，每分钟水解各底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量为1个纤维素酶活力。酸性蛋白酶活力测定采用福林酚法。酶活定义为：在pH值为3.0，温度为40℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位（U）。木聚糖酶的活性测定采用李彩霞（2001）介绍的方法。酶活定义为：在pH值为4.8，温度为50℃的条件下，每分钟产生1μmol木糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活力单位（U）。2结果与分析2.1培养基含水量对不同酶活性的影响用不同水分含量的培养基进行发酵试验，发酵结束后测定发酵基质中纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的酶活（结果见图1）。从图1可以看出：培养基含水量对各种酶组分产酶量具有显著性影响，CMC酶在水分含量60%时产酶活性最高；而FPA酶酶活和β-葡萄糖苷酶在水分含量在55%时产酶活性最高；木聚糖酶在水分含量60%～70%时产酶活性较稳定；酸性蛋白酶在水分含量50%～55%时产酶活性最高。本文综合考虑各种复合酶酶活，取培养基含水量为55%～60%为最佳。2.2起始ph值对菌株产酶的影响用不同起始pH值的培养基进行产酶试验，试验结果如图2所示。由图2可知，当培养基起始pH值低于5时对菌株产酶有一定影响，而在高于5较广的pH值范围内（pH值5.0～9.0）对菌株产酶影响不大。经测定，基础固体发酵培养基所配制的培养基提取液的自然pH值是5.40，因此，本研究以自然pH值为最终的发酵产酶培养pH值。2.3麸皮添加量对木聚糖酶活的影响在基础培养基中分别添加1g不同种类的碳源进行产酶试验（见图3）。由图3结果显示，添加麸皮有利于纤维素酶酶活和酸性蛋白酶酶活的提高，但所有的辅助碳源的添加都不利于木聚糖酶酶活的提高。经综合考虑，确定添加少量的麸皮作为培养基的辅助碳源。2.4氮源对葡萄糖苷酶产酶率的影响在基础培养基中分别添加0.05g不同氮源进行发酵试验（见图4）。由图4结果显示，氮源的添加对复合酶的生产具有显著影响。添加各种氮源都能明显提高β-葡萄糖苷酶的产酶率，其中（NH4)2SO4、NH4NO3、CO(NH)2和Mg(NO3)2能提高一倍以上。NH4NO3和CO(NH)2能较大幅度的提高FPA产量（分别比对照提高了29%和50%）。各种氮源对CMC酶活的提高效果都不大，所添加的氮源除了（NH4)2SO4外对木聚糖酶都有一定的抑制作用。不同氮源对酸性蛋白酶的影响较大，其中CO(NH)2对酸性蛋白酶的产生具有较大的促进作用（产酶率提高31.2%）。2.5柑橘皮提取物的酶活将柑橘皮粉与豆粕配制成不同的比例进行发酵试验（见图5）。结果发现，当不添加豆粕的时候，几乎不产酸性蛋白酶。当柑橘皮粉与豆粕的比例为8:2时，CMC酶、滤纸酶和木聚糖酶分别已经达到了酶活最高值；当柑橘皮粉与豆粕的比例为7:3时，酸性蛋白酶达到了酶活最高值；当柑橘皮粉与豆粕的比例为6:4时，β-葡萄糖苷酶达到最高值。综合考虑，认为柑橘皮粉与豆粕比例为7:3较合适。2.6酸性蛋白酶酶活在基础培养基上添加0.1g的各种无机盐。结果见表1。从表1可以看出，CaCl2对纤维素酶有提高作用，但对木聚糖酶有抑制作用；KH2PO4、K2HPO4能提高酸性蛋白酶酶活，但是对羧甲基纤维素酶和木聚糖酶有一定的抑制作用；Na2HPO4和NaH2PO4能使木聚糖酶酶活提高，且具有显著性差异，但是Na2HPO4对酸性蛋白酶有一定的抑制作用。MnSO4的添加能提高各类酶活，但不具有显著性差异，综合考虑各类无机盐对复合酶的影响，确定在培养基中添加MnSO4和Na2HPO4各0.1g。2.7最佳条件稳定性试验用柑橘皮粉53%、豆粕23%、麸皮19%、尿素1%、Na2HPO42%、MnSO42%以及水分含量为55%～60%的培养基进行浅盘扩大发酵试验，经干燥将所得发酵产物制成酶制剂粗制品。该粗制品为灰褐色粉末，易溶于水。各酶组分的活力分别为：CMC酶41.6U/g、β-葡萄糖苷酶102.2U/g、木聚糖酶2079.6Ug、酸性蛋白酶7884