紫花杜鹃干燥叶片中黄酮类化合物的提取及纯化研究

紫花杜鹃干燥叶片中黄酮类化合物的提取及纯化研究

紫草是杜鹃科植物。干燥的叶子和树枝的味道略带辛辣味道，略带温暖，可以治疗慢性支气管炎、咳嗽和粘液。广东省岭南地区也有许多慢性支气管炎、咳嗽和粘液。紫花杜鹃中含有槲皮素(quercetin)、槲皮苷(quereitrin)、金丝桃苷(hyperoside)等多种黄酮类化合物,对哮喘、痰多及支气管炎有显著疗效,现代药效学也表明其中黄酮类化合物为镇咳化痰有效成分。膜分离技术是一种使用半透膜的分离方法,如今已广泛用于海水淡化、纯水制造、溶液浓缩、蛋白质等溶质分离、纯化精制等方面[7,8,9,10,11,12,13]。膜分离技术是借助于人工合成的、具有选择透过性的膜,利用压力差、温度差、电位差作为推动力,基于物质能否透过膜或透过膜的速率不同,使流体中各成分得以分离、分级或富集的技术。其分离过程没有加热、冷却工艺,介质没有温度变化,不会产生相变;无需使用化学药品或添加剂,能保持生物稳定性;在液体浓缩的同时,可以兼除小分子物质和细菌;由于膜分离技术具有这些优点,特别适用于热敏性物质和生物活性物质的处理,在中药中活性成分的富集纯化方面已取得了应用。因此,本研究将利用膜分离技术对紫花杜鹃中黄酮类化合物提取物进行纯化。1材料和方法1.1氯化铝等的合成紫花杜鹃的干燥叶与带叶嫩枝(紫花杜鹃产地罗定)。芦丁标准品(纯度99%);无水乙醇、三氯化铝、醋酸钾、醋酸均为分析纯;实验用水为蒸馏水。WFZ-UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;MilliporeLabscaleTFF超滤系统德国Millipore公司;3K30超速冷冻离心机博励行仪器有限公司。1.2方法1.2.1标准曲线的制作准确称取在120℃条件下烘至恒重的芦丁标准品10.00mg,于烧杯中用甲醇溶解,溶解完毕后转移至100ml容量瓶中,用甲醇定容,摇匀,得芦丁标准溶液,质量浓度为0.1mg/ml。精密移取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于20ml容量瓶中,加入2.5%三氯化铝溶液3.0ml与醋酸钾溶液(取醋酸钾9.82g,加适量水使之溶解,加醋酸2.0ml,定容至100ml)5.0ml,用甲醇定容后,放置40min;另取20ml容量瓶加入2.5%三氯化铝溶液3.0ml与醋酸钾溶液5.0ml,用甲醇定容作为空白对照液,采用比色法,在420nm波长处测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线见图1,线性回归方程为y=29.367x+0.0045(R2=0.9995)。1.2.2总黄酮提取率的测定及纯度的确定将提取液稀释至适当浓度,准确吸取稀释液1ml于试管中,按照1.2.1节方法进行测定,然后根据标准曲线计算其浓度C;再按下式计算总黄酮提取率及其纯度。式中:C为被测液中芦丁质量浓度(mg/ml);n为稀释倍数;V为提取液体积(ml);M为原料中总黄酮质量(g);m为提取浸膏质量(g)。2结果与分析2.1单因素试验的结果和分析2.1.1紫花不同破碎度对提取效果的影响分别称取紫花杜鹃干燥嫩叶粗粉与干燥嫩叶切片各10g,加入10倍量的水,水煎煮提取3次,每次1h,过滤,合并滤液。依照1.2.1节分别测定滤液中总黄酮质量浓度,由式(1)及式(2)计算黄酮类化合物提取率及其纯度,考察紫花杜鹃干燥嫩叶破碎度对提取效果的影响,结果见表1。以药材粗粉作为原料,黄酮类化合物的提取率高于药材切片作为原料,但其纯度偏低,说明药材粉碎后有利于活性成分的浸出,但同时杂质成分也随之浸出,综合考虑,选用药材切片作为实验原料。2.1.2浸泡时间对提取效果的影响称取紫花杜鹃干燥嫩叶切片10g,加入10倍量的水,水煎煮提取3次,每次1h,过滤,合并滤液;同时取等量的药材切片,加入10倍量的水,分别浸泡1、2、4h后,加热回流提取两次,每次1h,过滤,合并滤液,考察紫花杜鹃干燥嫩叶切片浸泡时间对提取效果的影响,结果见图2。由图2可见,随着浸泡时间的延长,黄酮类化合物的提取率呈上升趋势,当浸泡时间达到2h时,已接近最高提取率,之后随浸泡时间的延长,提取率增加不明显。而其纯度在浸泡时间为2h时达到最高值,之后随浸泡时间的延长而降低。药材的浸泡使水分子充分进入到药材内部,有利于其中活性成分的浸出,紫花杜鹃干燥嫩叶中含有多种复杂成分,浸泡时间越长,其他杂质成分溶入溶剂中越多,造成活性成分纯度迅速降低,综合考虑,浸泡时间为2h较优。2.1.3液料比的影响称取紫花杜鹃干燥嫩叶切片10g,共称取4份,分别加入80、100、120、150ml水,即采用液料比分别为8:1、10:1、12:1、15:1(ml/g),浸泡2h后,水煎煮提取3次,每次1h,过滤,合并滤液,考察液料比对提取效果的影响,结果见图3。由图3可见,当液料比为12:1(ml/g)时,黄酮类化合物的提取率及其纯度均达到最高值。一般来说,溶剂用量越大,药材浸泡越充分,产生的浓度差越大,有利于有效成分的浸出从而有利于提取。但当液料比达到一定程度时,活性成分已经基本释出完全,再增大液料比,提取率基本不增加,其他成分反而会大量溶于溶剂中,导致活性成分纯度降低,同时还起到稀释活性成分的作用,不利于后续的优化步骤。2.1.4提取次数的确定称取紫花杜鹃干燥嫩叶切片10g,共称取4份,加入120ml水,浸泡2h后,分别水煎煮提取1、2、3、4次,过滤,合并每份滤液,考察提取次数对提取效果的影响,结果见图4。由图4可见,随着提取次数的增多,黄酮类化合物的提取率呈增大趋势,但当提取次数为3次后,其纯度明显下降,说明提取次数为3次时,黄酮类化合物已基本完全浸出。2.1.5提取时间的影响称取紫花杜鹃干燥嫩叶切片10g,共称取4份。加入120ml水,浸泡2h后,水煎煮提取两次,提取时间分别为每次0.5、1、1.5、2h,合并每份滤液,考察提取时间对提取效果的影响,结果见图5。由图5可见,随着提取时间的延长,黄酮类化合物的提取率不断增高,提取时间大于1h后,提取率增长速度缓慢;提取时间为1h时,其纯度最高,继续增加提取时间反而下降。可见提取时间为1h,紫花杜鹃干燥嫩叶中活性成分已基本浸出。2.2不同因素对茬细胞提取的优化在以上单因素试验的基础上,选用紫花杜鹃干燥嫩叶切片为原料,在浸泡2h的条件下,对液料比、提取次数和提取时间对紫花杜鹃干燥嫩叶活性成分的提取效果的影响进行了L9(34)正交试验(表2),以获得紫花杜鹃干燥嫩叶中活性成分提取的优化工艺,结果见表3。由表3可见,液料比、提取次数和提取时间对黄酮类化合物的提取率及纯度均有较大影响,其中对提取率的影响大小顺序依次是提取时间>提取次数>液料比,提取率最高的条件均为A2B3C3,对纯度影响大小的顺序依次是提取次数>液料比>提取时间,纯度最高的条件为A2B2C1。从活性成分提取率、纯度、溶剂用量、工作效率等方面综合考虑,确定各因素较优的水平组合为A2B2C2,即液料比为12:1、提取次数为3次、每次1h。称取药材切片10g,浸泡2h后,按照优选出的工艺条件进行提取,重复3次,结果黄酮类化合物平均提取率及纯度分别为97.58%和13.95%。2.3膜分离技术对紫花杜鹃干燥叶片中的黄酮类化合物进行了探讨2.3.1离心分离法提取液中含有较多的固体杂质和相对分子质量较大的胶体、多糖和淀粉等,在进行中药膜分离时可能会造成膜的污染,降低膜通量,缩短膜的使用寿命,因此在膜分离前采用离心分离法去除紫花杜鹃干燥嫩叶提取液中的固体杂质。将提取液放入500ml的离心管中,调节转速为10000r/min,高速离心30min,滤液作为过膜分离供试液。2.3.2膜分离技术对紫花不同提取液的纯化效果取经过预处理的黄酮提取液,利用膜分离技术进行纯化。控制压力为0.35MPa,分别通过截留相对分子质量为105、5×104、104、5×103的膜,当提取液浓度较大,压力升高时,加等倍量的水稀释,如此反复3次。采用紫外-可见分光光度计测定透过液中所含黄酮类化合物的浓度,考察膜分离技术对紫花杜鹃干燥嫩叶提取液的纯化效果,结果见表4。由表4可见,通过不同截留分子量的膜处理后,浸膏得率明显下降,用截留相对分子质量为5×103的膜过滤后,黄酮类化合物的透过率仅为59.15%,透过率偏低;若直接采用截留相对分子质量为104的膜处理,提取液透过速度缓慢,延长实验周期,表明截留相对分子质量为105及5×103的膜可以有效去除紫茶提取液中大分子物质,因此,选择将提取液依次通过截留相对分子质量为105、5×104、104三种膜。当提取液透过截留相对分子质量为104的膜后,黄