灵芝液体发酵多糖三萜

摘要灵芝是我们中国从古至今一直在延用的一种名贵中药材，具有很高的药用价值，其中含有的多糖和三萜是真菌重要的活性物质。采用Plackett-Burman法分析不同碳源对灵芝多糖以及三萜合成的影响。以不同时期灵芝发酵液的提取产物作为研究材料，测定发酵液中所含有的灵芝多糖含量和三萜含量，并利用Plackett-Burman法分析不同时期的多糖含量，评价多糖含量与不同碳源的相关性。实验结果表明，培养基添加果糖、乳糖，麦芽糖碳源组对灵芝胞外多糖的产量影响最大；果糖、乳糖，麦芽糖碳源组对灵芝三萜产量的影响最大；葡萄糖，蔗糖碳源组合对灵芝生物量的产量影响最大；蔗糖，麦芽糖碳源组合对灵芝胞内多糖的产量影响最大。本研究可为灵芝发酵提高重要参考。关键词：灵芝；液体发酵；多糖；三萜；Plackett-BurmanAbstractGanodermalucidumisarareChinesemedicinalmaterialthathasbeenusedinChinasinceancienttimes.Ithashighmedicinalvalue.Thepolysaccharidesandtriterpenescontainedinitarethetwoimportantactivesubstancesofthisfungus.TheeffectsofdifferentcarbonsourcesonthesynthesisofGanodermalucidumpolysaccharidesandtriterpeneswereanalyzedbyPlackett-Burmanmethod.ThepolysaccharidecontentandtriterpenecontentinG.lucidumfermentationbrothweredeterminedbyusingtheproductextractedfromG.lucidumfermentationbrothindifferentperiods,andthepolysaccharidecontentindifferentperiodswasanalyzedbyPlackett-Burmanmethod,andthecorrelationbetweenpolysaccharidecontentanddifferentcarbonsourceswasevaluated.ThisstudycanprovidesomereferencedataandconclusionsfortheefficientapplicationofG.lucidumandthehighqualityresearchanddevelopmentofhealthcareproducts.Theresultsshowedthattheeffectoffructose,lactoseandmaltoseontheextracellularpolysaccharideofG.lucidumwasthegreatest.Fructose,lactoseandmaltosehadthegreatestinfluenceonthecontentofG.lucidumtriterpenes.ThecombinationofglucoseandsucrosehadthegreatesteffectonthebiomassofGanodermalucidum.ThecombinationofsucroseandmaltosehadthegreatesteffectontheintracellularpolysaccharideofG.lucidum.Keywords：Ganodermalucidum;Polysaccharide;triterpenoids;liquidfermentation;Plackett-Burmanmethod目录1.引言 11.1.灵芝的概述 11.1.1.灵芝简介 11.1.2.灵芝的主要成分 11.2.灵芝多糖简介 11.2.1.灵芝多糖的功能活性 21.3.灵芝三萜简介 31.3.1.灵芝三萜的功能 31.4.灵芝多糖提取 41.5.灵芝三萜提取 41.6.外源物质对灵芝三萜合成的影响 51.7.课题的研究背景与内容 52．材料与方法 62.1.材料、药品及仪器 62.1.1.菌种 62.1.2.试剂 62.1.3.基础培养基成分 62.2.主要仪器 72.3.方法 72.3.1.Plackett-Burman实验设计 72.3.2.菌种活化 82.3.3.液体种子制备 82.3.4.液体发酵 82.3.5.生物量测定 82.3.6.多糖测定 92.3.7.菌丝三萜含量测定 93.结果与分析 93.1.Plackett-Burman试验设计结果 93.2.Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝多糖合成的影响 103.3.Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝三萜合成的影响 113.4.Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝胞内多糖合成的影响 124．小结与讨论 12致谢 13参考文献 13PAGE15Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝多糖以及三萜合成的影响1．引言1.1.灵芝的概述1.1.1.灵芝简介灵芝（Ganodermalucidum），别名红芝、木灵芝，是一种多孔蓖科真菌灵芝的子实体，植物本身呈现出强烈的漆感光泽,外貌主要的特征是当其菌盖孔口外表湿润时会呈现鲜美色泽，颜色丰厚饱满。多孔灵芝生长在中国东亚暖温带和亚热带的地区,全国各省都曾有研究发现灵芝的繁殖和生长[1]。灵芝在中医学中有着重要的地位，是我国历史有名的药材之一。灵芝拥有很多对人体调节和保持健康的好处，尤其是调节免疫系统上,对各种肿瘤的扩大和扩散都有一定的抑制作用[2,3]。甚至Ganodermalucidum还可用作在临床治疗患者时，起到消炎、止痛、止血和补充营养等效果[4]。经过长期科学研究和临床治疗，能从灵芝里分离出的成分包括三萜、多糖、蛋白质及生物碱[5-7]。研究发现多糖有调节免疫[8]，控制血糖，治疗溃疡，抑制氧化，延缓衰老，防止肿瘤等药用价值和临床意义。1.1.2.灵芝的主要成分灵芝含有蛋白质、氨基酸、甾醇、三萜类化合物、多糖和生物碱等多种重要活性成分[9]。我们将一层一层的面纱揭下，看到内部的成分，并更加准确地应用于实际生产生活。刘松照[10]等学者的结果表明，利用灵芝子实体中的三萜类化合物提取得出了：3种灵芝醇、2种灵芝烯醇和l6种灵芝酸等多种三萜类成分。灵芝多糖也是学者们争相研究的活性物质，多糖在临床治疗中也广受关注。1.2.灵芝多糖简介我们可以在灵芝的菌丝体、子实体，发酵液中分离提取出各种类型的灵芝多糖[11]。多糖里主要是β–葡聚糖，小部分是α–葡聚糖，灵芝多糖主要含有以下单糖:D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，L-岩藻糖等。以螺旋缠绕的方式将三股单糖链绕成多糖链，其3D结构与脱氧核糖核酸相似，在空间结构层中以氢键连接而成。此外，对灵芝的研究，不论是国内还是国外，都不乏有专家学者研究灵芝多糖的生物化学性质，且越来越多的结果表明了，灵芝多糖具有显著的生产价值和临床治疗的意义。1.2.1.灵芝多糖的功能活性（1）抗氧化作用近几年来，越来越多的人注重养生，而养生最主要的就是延缓身体衰老程度，人体的衰老，主要依靠人体中自由基的含量来决定。有学者应用激光共聚焦方法，测定灵芝多糖对小鼠腹部存在的巨噬细胞里的氧自由基含量，明显观测到灵芝多糖拥有显著且有效的抗自由基能力[12]。（2）抗肿瘤作用生态环境被破坏得越来越严重，优质水资源的缺乏，空气治疗下降，被污染的土壤，人们生存环境遭到不可逆破坏，而且人们在电子产品的簇拥下，作息生活习惯严重混乱，导致健康无法得到良好地调节，人体免疫机制不能够有效地战胜癌细胞，导致癌细胞在体内疯狂地增值，从而形成癌症，运用破碎灵芝孢子粉可以使各项指标达到最佳效果，研究证明，灵芝孢子粉能够控制住肺癌荷瘤小鼠肿瘤进一步扩大[13]。（3）降血糖糖尿病患者在进食过量的糖食时，机体的激素调节跟不上节奏，或胰岛素不能与受体正常的结合，则会造成糖尿病及血糖含量超出正常范围值的结果。在实验中证明，灵芝多糖可以通过提高胰岛素与受体蛋白的结合速度，改善胰岛素的分泌情况，改善病情[14]。（4）调节免疫功能中医和西医最大的不同在于，中医是提高自身免疫能力或恢复自身机能进而对抗疾病；西医是用药物的特性直接攻击病毒细胞，或用药物对抗外在因素来维持身体各激素的分泌。李风华[15]等学者，环磷酰胺诱导雏鸡的免疫抑制的试验中，观察到注射灵芝多糖后能够维护雏鸡的免疫抑制作用，为免疫细胞存活增殖，所以灵芝这一中药材对提高免疫力有显著作用。（5）抗疲劳现代很多人群出现亚健康状态，年纪轻轻就出现很多意想不到的疾病。在研究中发现，灵芝制剂能够降低血清中TC、TG、FFA水平，从而具有缓解疲劳和恢复体力的作用[16]，疲劳得到缓解才能更加高效地投入工作和生活中去。1.3.灵芝三萜简介灵芝具有丰富的化学物质，在灵芝中提取出大约有150种三萜化合物质[17]。何为三萜？三萜是由6个“异戊二烯”组合而成的化合物，其化学式为（C5H8）6。作为总称叫做灵芝三萜，而四环三萜和五环三萜是灵芝孢子粉中能够消灭癌细胞作用的化合物，所有灵芝三萜并非都能够有效地抑制癌细胞的生长繁殖。现在医学技术的快速发展，医学检测技术已经可以快速有效地检测出癌细胞，癌症患者也慢慢走进我们的生活中来，在癌症的早期或者中期被治愈的几率都是很大的，但大部分人是在身体严重不适后才去检查，确诊后可能已经是中晚期或更严重的情况，这种情况，多数人是采用介入手术加上靶向药物或者中药一同治疗，而中药里，灵芝孢子粉就是很好的选择。1.3.1.灵芝三萜的功能（1）保肝护肝肝病患者很难有效地利用肝脏进行解毒，增加了肝脏负担，如果不加以干预治疗，极大可能会患上肝癌。王洪庆[18]等学者将灵芝三萜应用于人体肝脏，测肝细胞成活率，观察到肝脏细胞成活率增大，进一步证明灵芝三萜对肝细胞具有保护作用。（2）抗癌功效最近国内外，部分学者的研究均证明灵芝三萜是一类显著得防癌细胞物质，灵芝三萜运用细胞毒效果来对抗肿瘤生长[19]。灵芝三萜的提取物用于上皮细胞间充质转化的调节(EMT)，以及用于原癌基因(c-myc)的调控，以此来防止前列腺癌。报道还表明，灵芝有阻止5-a还原酶的活性作用，阻止雄激素产生受体活性，降低癌变几率[20]。（3）改善睡眠睡眠是人类调节身体激素分泌和缓解疲劳的重要生物活动，当人到老年，睡眠质量会有所下降，造成失眠和睡眠时长下降得结果，导致人体机能得不到有效地调节，生物钟混乱后，就容易出现一些不可预料地疾病。在有关于优化小白鼠睡眠质量的实验里，发现灵芝三萜酸有增加睡觉质量和延长睡眠时间的作用，从而得出，灵芝三萜酸具有优化睡眠的功能[21]。（4）抗菌、抗病毒王开金等[22]探究了灵芝提取物GLTs的相关作用，从耻垢分枝杆菌的增殖曲线，以及GImU基因的表达，包括细胞壁结构变化的研究里，发现灵芝提取物GLTs对M.S-155病毒的抑制具有明显的作用。1.4.灵芝多糖提取（1）水溶提取法杨晓梅等[23],在实验中运用水溶提取法来提取灵芝子实体中的多糖成分。实验步骤：eq\o\ac(○,1)称量，eq\o\ac(○,2)加料液，eq\o\ac(○,3)热水浸提，eq\o\ac(○,4)过滤，eq\o\ac(○,5)热水浸提，eq\o\ac(○,6)过滤，eq\o\ac(○,7)醇析，eq\o\ac(○,8)离心，eq\o\ac(○,9)取沉淀，eq\o\ac(○,10)除游离蛋白，eq\o\ac(○,11)离心取上层液。再利用苯酚-硫酸法来检测灵芝粗多糖溶液中西藏野生灵芝子实体粗多糖含量。该方法相较于其他多糖提取法来说，在灵芝多糖的提取率上处于一个中等水平。此方法可以运用于野生灵芝的驯化工作。（2）超声波提取法超声波的使用，可使得物质强烈震荡摇摆，剧烈的空化反应和高效的混合效果，让分子和物质加快运动，类似于催化反应一般，缩短物质之间反应所需要的时间，有效地使各个成分与溶剂混合均匀，从而增加多糖的提取效率[24]。（3）酶法酶法能有效地提取药物成分，并起到显著作用，找到适宜的酶以利用，助于降解细胞壁和细胞质基质之间的纤维素、半纤维素，细胞的原有结构毁掉后，降低物质结合的外力，加大成分产出。（4）微波辅助法微波萃取法在国内受到大量运用，常见在中医药学里，用于提取药物中有效物质，有助于实验中对多糖的提取，能对多糖生物活性成分高的物质进行筛选，较少实验资源的浪费，缩短实验工序。（5）高压热水提取法主要原理是使用高压将细胞破碎,使得多糖从细胞中流出,高压热水提取法便于操作，工序简单。1.5.灵芝三萜提取（1）超声波辅助法康同辉等[25]实验证明，超声波辅助法，有利于乙醇提取灵芝三萜。（2）灵芝三萜优等提取条件[26]浸提温度，浸提时间对灵芝三萜提取率的影响较为显著。最佳提取工艺参数:18倍的乙醇用量,提取温度在60°,提取的最优时间为2h，Ph值是8.5。1.6.外源物质对灵芝三萜合成的影响适量地加入一些外源物质可以有效地提高灵芝三萜地产出率。赵艳等[27]研究证明,使用一些中药材可以提高灵芝三萜提取率，比如加入相对含量的金银花、枸杞子或者连翘水提物和醇提物有助于灵芝三的产出率的提高,相反金银花和银杏的水提物和醇提物对三萜的产出率有所降低。赵小瑞等[28]证明,黄芪、甘草、党参、当归能够激发三萜的产出率。1.7.课题的研究背景与内容背景在于：栽培法生产灵芝具有明显的缺点，如栽培周期长、占地面积大、目前，灵芝主要通过人工栽培的方法进行生产，获得其子实体。灵芝子实体可直接作为中药材，或以此为原料产品质量不稳定以及不易工业化生产。近年来，液体深层发酵法由于其周期短、产品质量稳定，且可大规模工业化生产，因此灵芝液体深层发酵法开始广泛应用于灵芝生产，以菌丝体、多糖以及三萜为主要目标产物。内容有：以不同时期灵芝发酵液的提取产物作为研究材料，测定发酵液中所含有的灵芝多糖含量和三萜含量，并利用PB法分析不同时期的多糖含量，评价多糖含量与不同碳源的相关性。获得对灵芝多糖、三萜产量，生物量有利的碳源，对进一步开发利用和提高经济效益提供参考。意义在于：碳源是大型真菌进行液态发酵的重要营养,对其生长代谢及其发酵产物的形成有直接的影响，探索不同碳源对灵芝菌丝量、灵芝多糖含量及三萜产量的影响,对推动灵芝发酵高效生产，有重要作用和积极意义,为灵芝代谢产物的工业化生产提供理论支持实验依据。采用液体发酵灵芝菌丝体，形成的产物不仅含有灵芝多糖,还有大量次生代谢产物,利用液体发酵代替栽培法，是一种潜在的新途径。中国已经是世界第二大经济体，人民的生活水平和质量也在日益提升，年轻人为了实现自己的人生价值，愿意来到更大的城市发展自己事业，接踵而来的是，人们压力剧增，生活节奏不规律，导致亚健康。亚健康的人群，身体虽然没有患病，却出现了生理机能减退，代谢水平低下，主要表现于疲劳、胸闷、头痛、失眠、健忘、腰酸背痛、情绪不稳定，工作效率低下等。呼吁养生的人群出现，比如枸杞菊花泡水有利于缓解疲劳。在日本也有以茶为原料的各种饮品，最近，在中国这些饮品也很畅销，其中的营养成分含量是否充足，暂且不明，不过，这是个不错的发展方向。中国的中医历史悠久，经历历史的检验，临床实验表明，中药材具有的功效是强大的，比如灵芝，灵芝是著名的一味药材，将灵芝实现大规模生产，提高灵芝活性物质含量，是研究的关键。2．材料与方法2.1.材料、药品及仪器2.1.1.菌种灵芝菌种：灵芝NA34，宁德师范学院发酵实验室保藏。2.1.2.试剂主要所用试剂见表2-1-2表2-1-2主要试剂试剂名称规格生产厂家乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司苯酚分析纯国药集团化学试剂有限公司硫酸分析纯中国上海试剂香草醛分析纯国药集团化学试剂有限公司冰醋酸分析纯西陇科学股份有限公司高氯酸分析纯国药集团化学试剂有限公司葡萄糖分析纯天津市益力化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯天津化学试剂有限公司酵母粉生物试剂北京奥博星生物技术有限公司氢氧化钠分析纯西陇科学股份有限公司蛋白栋生物试剂天津市致远化学试剂有限公司2.1.3.基础培养基成分液体培养基（g/L）：40g葡萄糖，5g酵母粉，0.5g硫酸镁，1.0g磷酸二氢钾、4.0g蛋白胨。2.2.主要仪器主要所用仪器见表2-2。表2-2主要仪器设备名称型号生产厂家紫外可见分光光度计UV-5800PC上海元析仪器有限公司恒温水浴锅SB-1100上海爱朗仪器有限公司离心机3-16KL德国赛多利斯公司电子天平YP802N上海精密科学仪器有限公司中药粉碎机800A浙江永康市速锋工贸有限公司恒温培养摇床NRY-200上海南荣实验室设备有限公司电热恒温水槽DK-8D上海精宏实验设备有限公司双人单面净化工作台SW-CJ-2D苏州净化设备有限公司自动压力蒸汽灭菌器，GR-85-DR致微仪器有限公司2.3.方法2.3.1.Plackett-Burman实验设计Plackett-Burman法是在科学研究中常用的方法之一，是一种工艺优化，能在相对少的实验中快速地从大量的影响因素里筛选出显著影响因素。Plackett-Burman法适合使用在那些从众多考察因素中迅速地、有效地筛查出关键的因素，以最少实验次数来精确估计各因素的主要效果。各个因素选择高低两个水平数值,该因素高低水平值的差距要小，差距是一致的，安排了12种配方的培养基，是为了保证不对其他因素效果有所妨碍。其自变量、编码和水平因素见表2-3-1。表2-3-1Plackett-Burmandesign变量Variables因素（g/L）Factor低水平（-）Lowlevel高水平（+）HighlevelX1X2X3X4X5X6X7X8葡萄糖蔗糖dummy1dummy2果糖乳糖dummy3麦芽糖00-1-100-1015151115151152.3.2.菌种活化超净工作台上将菌种接种至液体培养基中，于恒温培养摇床上，28℃培养3d，让菌丝繁殖。2.3.3.液体种子制备超净工作台上从液体培养基中吸取10mL菌丝体分装到有不同碳源的80mL培养基的250mL三角瓶，置于恒温培养摇床上，160rpm/min、28℃培养5d，用于发酵实验。2.3.4.液体发酵接种至不同配方的液体培养基中，务必准确，过少会影响菌种生长，更多摇床中容易洒出，沾染瓶口的细菌，污染培养基。培养条件为160rpm/min、28℃培养5d。2.3.5.生物量测定用纱布过滤样品，用蒸馏水洗净残留的培养基等多余物质，反复清洗3次。将菌丝体至于过滤纸上，放进鼓风干燥箱60℃烘至一夜恒重，（恒重即是第一次称取后间隔一段时间再次称取，前后重量不变，则达到恒重。）电子天平称量，即为菌丝生物量。2.3.6.多糖测定（1）胞外多糖测定eq\o\ac(○,1)取到0.1mL发酵液，添加95%乙醇4mL，4℃冰箱过一夜；eq\o\ac(○,2)8000rpm离心后15min，弃掉上清液，往沉淀中加入3mL去离子水溶解混合均匀；eq\o\ac(○,3)吸取样液0.01mL，加入0.99mL去离子水以及0.5mL5%苯酚震荡匀，与2.5mL浓硫酸混合均匀后，静置5min；eq\o\ac(○,4)100℃沸水浴里加热15min，凉水冷却，在490nm处测定吸光度值，以葡萄糖为标准品建立标准曲线，标准曲线为：y=0.0145x-0.0386，R2=0.9984。（2）胞内多糖测定eq\o\ac(○,1)将菌丝体烘干磨成粉末，准确称取0.1g，加1mol/L氢氧化钠5mol，用60℃水浴加热1h；eq\o\ac(○,2)取0.01mL样液，加入0.99mol去离子水，再加0.5mol的5%苯酚摇匀，加入2.5mL95%硫酸混匀，静置5min；eq\o\ac(○,3)100℃沸水浴加热15min，凉水冷却，在490nm处测吸光度值，根据标准曲线计算发酵液多糖浓度。2.3.7.菌丝三萜含量测定eq\o\ac(○,1)菌丝干研磨成粉末，称取0.1g，加入95%乙醇2.5mL，30℃摇床3h；eq\o\ac(○,2)取0.2mL,60℃水浴蒸干，分别加入香草醛-冰醋酸0.5mL和高氯酸溶液0.8mL,混匀；eq\o\ac(○,3)60℃水浴15min冷却，最后加入2mL冰醋酸，静置30min，以乙醇蒸干作为对照，于540nm处测吸光度值，以熊果酸为标准品建立标准曲线，标准曲线为：y=0.0065x+0.0065，R2=0.992。3．结果与分析3.1.Plackett-Burman试验设计结果Plackett-Burman试验设计结果见表3-1。采用Design-Expert软件对表3-1中的胞外多糖、三萜、生物量，胞内多糖含量进行统计分析，对胞外多糖、三萜，胞内多糖含量数据进行回归分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性。表3-1Plackett-Burman试验设计结果SerialnumberX1X2X3X4X5X6X7X8胞外多糖（g/L）三萜含量（%）生物量（g）胞内多糖（g/L）1++-+++--2.490.650.426.92-++-+++-0.680.350.656.653+-+++1.80.520.677.394+-++-+++2.90.660.447.15--+-++-+3.040.950.545.556-+-++-++2.070.260.325.927++++-0.70.380.945.358++-++2.920.560.556.369+-++-1.730.690.725.810+++-+2.900.640.245.71192.312-++++2.710.380.468.22由表3-1可知，培养基添加果糖、乳糖，麦芽糖碳源组合时，碳源对灵芝胞外多糖的产量影响最大；培养基添加果糖、乳糖，麦芽糖碳源组合时，对灵芝三萜产量的影响最大；培养基添加葡萄糖，蔗糖碳源组合时，对灵芝生物量的产量影响最大；培养基添加蔗糖，麦芽糖碳源组合，对灵芝胞内多糖的产量影响最大。3.2.

Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝多糖合成的影响表3-2为不同碳源对灵芝多糖合成的影响及贡献值。表3-2胞外多糖偏回归系数及影响因子的显著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0340.517.613X2-0.014-0.211.237X3-0.057-0.110.378X40.260.517.514X50.0180.282.216X60.0350.527.912X7-0.20-0.394.395X80.0971.4661.251从表3-2可以看出，麦芽糖（X8）对灵芝胞外多糖合成的影响最大，其次为乳糖（X6）。其中，葡萄糖、麦芽糖，乳糖对胞外多糖含量的影响是正效应，蔗糖对胞外多糖含量的影响是负效应3.3.

Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝三萜合成的影响不同碳源对灵芝三萜合成的影响见表3-3所示。表3-3三萜含量偏回归系数及影响因子的显著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0550.116.474X2-0.070-0.1410.472X30.0270.0531.527X40.0130.0270.388X50.0350.0702.625X60.140.2943.911X7-0.030-0.0061.926X80.0620.128.133从表3-3可以看出，蔗糖、麦芽糖和乳糖对三萜含量影响较大。其中，麦芽糖，乳糖对三萜含量的影响是正效应，蔗糖对三萜含量的影响是负效应。3.4.Plackett-Burman分析不同碳源对灵芝胞内多糖合成的影响不同碳源对灵芝胞内多糖合成的影响见表3-4所示，表3-4胞内多糖偏回归系数及影响因子的显著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.360.736.672X20.350.711.506X30.611.214.423X40.791.577.391X50.360.721.545X60.180.360.397X70.0930.190.18X80.370.741.664可以看出，葡萄糖和麦芽糖对胞内多糖含量影响较大。另外，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖，乳糖对胞内多糖含量的影响是正效应。4小结与讨论试验结果表明，不同碳源对灵芝多糖和三萜产量有显著影响，培养基中加入果糖、乳糖，麦芽糖碳源组合对灵芝胞外多糖的影响最大；蔗糖、果糖，乳糖碳源组合对灵芝胞外多糖的影响最小。培养基中加入果糖、乳糖，麦芽糖碳源组合对灵芝三萜含量的影响最大；蔗糖、果糖，麦芽糖碳源组合的影响最小。培养基中加入葡萄糖，蔗糖碳源组合对灵芝生物量的影响最大；葡萄糖、蔗糖、乳糖，麦芽糖碳源组合对灵芝生物量的影响最小。培养基中加入蔗糖，麦芽糖碳源组合对灵芝胞内多糖的影响最大；葡萄糖，蔗糖碳源组合对灵芝胞内多糖的影响最小。曾晓希等[29]的实验中发现，不同碳源对灵芝胞外多糖合成含量的影响是葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞麦芽糖＞可溶性淀粉。乳糖:它是由半乳糖和葡萄糖过β-1,4糖苷键构成的双糖[30]。果糖：它是葡葡糖的同分异构体.具左旋性,称左旋糖[31]。蔗糖与麦芽糖是同分异构体，都是二糖，蔗糖水解成一分子葡萄糖，一分子果糖。麦芽糖水解为二分子葡萄糖。葡萄糖，是一种单糖，一种多羟基醛。可以发现，单糖即是葡萄糖作为唯一碳源时，可以最好的合成灵芝多糖，被菌丝体直接利用，二糖要先水解为单糖后被菌丝体吸收，因而用单糖作碳源，合成的灵芝多糖含量多，生成的灵芝菌丝体生物量多。本实验结果显示，混合的碳源所合成的多糖与三萜含量多于单种碳源作为培养基的。本实验中，乳糖作为唯一碳源的培养基，最适于菌丝体的生长。李平作等[32]的研究发现，在灵芝液体发酵过程中，可以清晰地观察到菌体的形状在前48小时里呈现为丝状体，两天后转变成球状体，第三天起部分丝状体开始有所变化。菌球的外形体征可分为松散型和紧密型；球状菌体其数量和直径成反比。杨德等[33]在实验中发现，培养基中加入天然成分，其产生的多糖含量相对多，其中的因果关系可能是蛋白质、维生素等营养物质存在于天然物质中，使得灵芝生长具有丰富的营养；或者,天然成分中的物质将大分子物质分解后吸收利用，存在的小分子物质，类似于多糖片段的，则会造成检测中测定的多糖含量增高。响应面法，当发酵时间为42h、发酵温度为28.7℃时，在对应条件下所生成的多糖含量最高，当加入葡萄糖和蔗糖作为碳源时产生的生物量最高。实验中难免会因为操作不当，或在摇瓶发酵中受到外界细菌的污染，因而在培养基中加入一定量的抗生素，防止污染发生，这样实验才能顺利进行。参考文献[1]戴玉成,曹云,周丽伟,吴声华.中国灵芝学名之管见[J].菌物学报,2013,(32):947-952.[2]J.Zhang,Y.J.Liu,H-S.AntitumoractivityofsulfatedextracellularpolysaccharidesofGanodermalucidumfromthesubmergedfermentationbroth[J].Carbohydr.Polym,2012(87):1539-1544.[3]E.Furusawa,S.C.Chou.AntitumouractivityofGanodermalucidum,anediblemushroom,onintraperitoneallyimplantedLewislungcarcinomainsynergenicmice[J].Phytother.Res,1992(6):300-304.[4]K.Koyama,T.Imaizum.AntinociceptivecomponentsofGanodermalucidum[J].PlantaMed,1997(63):224-227.[5]S.B.Lin,C.H.Li,S.S.Lee.Triterpene-enrichedextractsfromGanodermaluciduminhibitgrowthofhepatomacellsviasuppressingproteinkinaseC,activatingmitogen-activatedproteinkinasesandG2-phasecellcyclearrest[J].LifeSci,2003(72):381-2390.[6]H.Kohda,W.Tokumoto,K.Sakamoto.ThebiologicallyactiveconstituentsofGanodermalucidum(Fr.)Karst.Histaminerelease-inhibitorytriterpenes[J].Chem.Phar.Bull,1985(33):1367-1374.[7]B.Boh,M.Berovic,J.S.Zhang,Z.B.Lin.Ganodermalucidumanditspharmaceuticallyactivecompound[J].Biotechnol.Annu.Rev,2007(13):265-301.[8]M.Shi,Z.Y.Zhang,Y.N.Yang,AntioxidantandimmunoregulatoryactivityofGanodermalucidumpolysaccharide(GLP),Carbohydr[J].Polym.2013(95):200-206.[9]张瑞婷,周涛,宋潇潇,等.灵芝活性成分及其药理作用的研究进展[J].安徽农业科学,2018,46(03):18-22.[10]刘松照,王国凯,彭灿,等.灵芝三萜类化学成分研究[J].现代中药研究与实践,2017(4):41-46.[11]李广远,杨雅丽,王晶,等.灵芝多糖对NB4细胞凋亡及Egr-1表达的影响[J].中药新药与临床药理,2013,24(05):476-479.[12]梁磊,黄清铧,王庆福,等．响应面优化微波一超声波协同提取灵芝三萜工艺及其清除自由基活性[J].菌物学报,2017(4):512-521.[13]王昕妍,陈国杨,苏洁,等.灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长和VEGF表达的比较研究[J].中药药理与临,2017(2):118-122.[14]刘聪,冉春枭,钟民涛,等.灵芝多糖对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI一3Kp85和GLUT4蛋白表达的影响[J].中国微生态学杂志,20