基因工程原理与技术（第四版）课件 第7、10章 酵母基因工程2X、基因工程相关技术

第七章

酵母基因工程第二节常见的酵母基因表达系统本章内容第一节酵母基因工程表达体系第四节酵母基因工程应用举例---利用重组酵母

生产乙肝疫苗第三节影响外源基因表达的因素酵母菌的分类学特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由56个属和500多个种组成。酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。第一节酵母基因表达体系----宿主系统作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求①安全无毒，没有致病性。②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。④培养条件简单，容易进行高密度发酵。⑤有较强的蛋白质分泌能力。⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统酵母菌是最简单的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵亚母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。

假丝酵母属产朊假丝酵母(Candidautilis)酵母菌表达系统的选择

酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。

酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。

乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。

乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。表达系统优势：生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表达

由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有“十二五”普通高等教育国家级规划教材

多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列多型汉逊酵母表达系统HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多

目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。系统中获得成功表达。“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母中的2m环状质粒同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。第一节酵母基因工程表达体系

--------载体“十二五”普通高等教育国家级规划教材第一节酵母基因工程表达体系

--------载体酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材第一节

酵母基因工程表达体系

-------载体1．酵母载体的基本结构

DNA复制起始区：2μ质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）

筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选

整合介导区

有丝分裂稳定区

表达盒：

启动子，基因（分泌信号序列），终止子“十二五”普通高等教育国家级规划教材2酵母载体的种类酵母整合型质粒YIp：缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因。具有整合介导区，所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定(a)。酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分为下列五类：酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类“十二五”普通高等教育国家级规划教材含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建

在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高（b）。

酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个（c）。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材

ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。

以ARS为复制子的质粒称为YRp

上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，

以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。“十二五”普通高等教育国家级规划教材2酵母载体的种类酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。

CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp.YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。

YAC载体在宿主细胞中以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb的外源DNA片段。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材主要结构：

①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；③一个自主复制序列(ARS1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点；⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌的转化方法用于转化子筛选的标记基因“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌转化方法原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。Li+盐转化方法：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌转化方法电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105/mgDNA）。PEG转化法：PEG1000“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母细胞转化特点单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或同源整合入染色体（不含复制子）克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%“十二五”普通高等教育国家级规划教材用于转化子筛选的标记基因

营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因“十二五”普通高等教育国家级规划教材用于转化子筛选的标记基因其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因aph

氨基糖苷转移酶抗G418

cat

氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr

二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

铜离子螯合物耐受铜离子suc2

蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型“十二五”普通高等教育国家级规划教材第二节常见的酵母基因表达系统一、酿酒酵母表达系统1，启动子

组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）

“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭23℃诱导表达温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性a–a

型启动子酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型温度控制型启动子a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型启动子

受体细胞基因组

重组质粒a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型启动子a2a125℃35℃（–）“十二五”普通高等教育国家级规划教材酵母菌启动子的可控性酿酒酵母超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1

GAL7和

GAL10基因编码“十二五”普通高等教育国家级规划教材杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母表达载体目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp)（见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp)；（4）酵母整合型质粒(YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序列，能够自主复制，通常为多拷贝数“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母宿主

有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1

改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2

提高重组蛋白表达转录后加工rgr1

提高重组蛋白表达转录水平ose1

提高重组蛋白表达转录水平ssc11

改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点“十二五”普通高等教育国家级规划教材酿酒酵母宿主

为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应

许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。

酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌有四个泛素编码基因：UBI1

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3

编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4

编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7“十二五”普通高等教育国家级规划教材减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能UBI4缺陷型：外源基因表达理想的受体正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，UBA1缺陷型：减少蛋白降解UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：减少蛋白降解七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效“十二五”普通高等教育国家级规划教材二、毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统

1.启动子

（1）AOX1和AOX2启动子（2）三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）启动子（3）甲醛脱氢酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）启动子“十二五”普通高等教育国家级规划教材2毕赤酵母表达载体类型胞内表达载体pPICZA,B,C分泌型表达载体pPICZaA,B,C“十二五”普通高等教育国家级规划教材毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重组整合入酵母染色体DNA中，并随酵母的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生。3载体的整合方式依据具体整合位点及相应产生的转化子的类型可分为三种情况：“十二五”普通高等教育国家级规划教材5’AOX1和3’AOX1与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因。这种情况有功能的AOX1基因被替换而丢失后，只能利用弱的AOX2基因启动合成AOX，就产生His+MutS表型(methanolutilizationslow)，在含甲醇的培养基中生长缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发生置换，使得一个或多个表达单位插入在his4位点，产生的表型也是His+Mut+染色体AOX1区与载体质粒的AOX1区发生单位点互交换，外源基因的表达单位插入在基因区AOX1基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种情况AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产生的表型是His+Mut+。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材在毕赤酵母中有3种方法可以得到多拷贝表达菌株。第一种方法直接构建含高拷贝外源基因的表达载体，在体外利用同尾酶向载体中多次插入首尾相连的表达盒。此法的优点是一次整合，即可有多个表达盒插入染色体。但体外基因操作较繁琐。第二种方法是利用含有kanr基因的载体。细菌来源的卡那霉素抗性基因在酵母中赋予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致与载体的拷贝数相关。提高抗生素G418的浓度可以得到含高拷贝表达载体的转化菌株。第三种方法是用含有Zeocin抗性标记基因Shble的载体来构建多拷贝菌株。来源于细菌的Shble在酵母中赋予宿主对抗生素zeocin的抵抗能力，通过提高zeocin浓度可筛选出含高拷贝表达载体的转化菌株。然而与G418筛选相似，大多数能抵抗高水平zeocin的转化子并不含有多载体拷贝。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材4宿主常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168为蛋白酶缺陷型，以其作为宿主表达蛋白可以降低表达产物的降解。这些表达宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生来的。最常用的受体菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一个组氨醇脱氢酶缺陷型基因His4，可接受含His4的载体而具有His+表型来筛选转化子。根据对甲醇利用的情况，毕赤酵母可划分为三种表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；当AOX1被其他基因取代，则需依赖AOX2，但其甲醛代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为甲醇利用负表型（Mut-），如MC100-3。后两者胞内表达外源蛋白质有时优于野生株，且需甲醇较少。此外为增加分泌蛋白质稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。“十二五”普通高等教育国家级规划教材第三节影响外源基因表达的因素外源基因稳态mRNA的浓度优化翻译起始区前后mRNA的二级结构，提高外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的一、转录水平控制二、表达载体的拷贝数和稳定性三、其他因素“十二五”普通高等教育国家级规划教材优化工程菌发酵工艺避免表达产物在细胞内的降解，选择或改造宿主，如：采用二倍体宿主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为宿主第三节影响外源基因表达的因素“十二五”普通高等教育国家级规划教材

利用重组酵母生产乙肝疫苗第四节酵母基因工程应用实例

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

利用重组酵母生产乙肝疫苗产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质

乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，病毒颗粒呈乙型肝炎病毒的结构球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、

此外，被乙肝病毒感染的人肝脏还能合成并释放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是各种未装配的包装蛋白的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa“十二五”普通高等教育国家级规划教材乙型肝炎病毒的结构与性质

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的传统乙肝疫苗的制备乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞膜上提取出来的。这种来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。“十二五”普通高等教育国家级规划教材产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母

20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。

目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。

进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。“十二五”普通高等教育国家级规划教材产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+的转化子重组分子转化his-的受体细胞染色体DNA“十二五”普通高等教育国家级规划教材产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。

重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%

在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

小结

酵母基因工程，是根据酵母密码子偏好从头设计后化学合成或者PCR扩增获得目的基因片段与载体DNA，经过体外酶切、连接和重组，然后采取适当的转化方法，将重组后的带有外源基因的载体DNA导入酵母细胞，并使其在酵母细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体酵母细胞遗传特性或者获得基因工程表达产物的目的。主要研究内容包括目的基因克隆，确定合适的酵母基因工程受体菌与载体系统，采用相应转化方法以及转化子的筛选与表型鉴定，重组基因工程酵母中目标蛋白的诱导和表达。“十二五”普通高等教育国家级规划教材

利用酵母表达外源蛋白既可以在胞内，也可以分泌到胞外。酿酒酵母和毕赤酵母已成为高等真核生物基因的优良宿主系统。针对不同的表达宿主菌开发了相应的表达载体。酿酒酵母表达载体有基于酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序构建的游离自主复制型质粒载体，也有整合型载体。但是由于毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠同源重组将外源基因表达序列整合入受体细胞的染色体DNA上，构建稳定的毕赤酵母工程菌。

“十二五”普通高等教育国家级规划教材

酵母菌基因转移方法有：原生质球法、电击转化法、PEG方法和Li+盐转化方法。筛选方法主要是：营养缺陷型筛选和抗生素抗性筛选。

将来表达系统发展的方向是采用自克隆技术构建的食品级表达系统。宿主为食品级微生物，载体采用食品级选择标记，既不能有抗生素标记存在。通常以缺陷型菌株作为受体菌，载体上携带有受体菌所缺陷的基因与受体菌互补，作为选择标记。“十二五”普通高等教育国家级规划教材思考题1，对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞有什么基本要求？2，什么叫穿梭载体？指出酵母穿梭表达载体pYES2每个元件的功能。3，毕赤酵母中三种表型Mut+，Muts，Mut-分别代表什么含义，各种表型是怎么产生的？4酿酒酵母和毕赤酵母表达载体中常用的启动子有哪些？哪些是诱导型的启动子？哪些是组成型的启动子？5，比较酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的优缺点。6，提高外源基因在酵母中的表达水平，考虑从哪些方面入手？

“十二五”普通高等教育国家级规划教材第十章

基因工程相关技术

第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第一节核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是根据核酸变性和复性的性质，应用核酸探针检测靶基因或靶序列的技术方法，是分子生物学领域应用最为广泛的技术之一。具有灵敏度高、快捷、简便易行等优点，被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突变的检测等。一、核酸杂交的原理利用具有同源性的两条核酸单链在一定的条件下退火，可按碱基互补原则形成双链，如果这两条链的来源不同，则形成杂交分子，形成的杂交分子的稳定性与两条链的互补性（亲缘关系）密切相互。因此，DNA/RNA的杂交可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而核酸分子杂交更重要的是可以用来检测核酸片段中某一特定基因的位置。一、核酸杂交的原理核酸分子杂交实验通常包括两步：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹（nucleicacidblotting）转移。主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dotandslotblotting）、菌落和噬菌斑印迹法（colonyandplaqueblotting）；第二，将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸分子杂交为印迹杂交。二、核酸探针的制备核酸分子探针:是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物（即标记物）进行标记。

1.探针的种类及其选择根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等几类。探针的选择应给予足够的重视并遵循如下原则：探针应具有高度特异性、来源要尽量方便、探针的序列结构应不受标记物的影响等。1.探针的种类及其选择(1)基因组DNA探针。克隆化的各种基因片段是最广泛采用的核酸探针，几乎所有的基因片段都可被克隆到质粒或噬菌体载体中，为获得大量高纯度的DNA探针提供了方便。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)也为DNA探针提供了另一方便的来源。(2)cDNA探针。cDNA中不存在内含子及其他高度重复序列或非编码序列，是一种较为理想的核酸探针，但cDNA探针不易获得，限制了它的广泛应用。另外，要注意cDNA中的poly(dT)可能产生的非特异性杂交问题。1.探针的种类及其选择(3)RNA探针。mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，因为：①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行(如杂交温度可提高10℃左右)，因而杂交的特异性更高。②单链RNA分子不存在互补双链的竞争性结合，与待测核酸序列杂交的效率较高。③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交也比较少。④杂交后可用RNase将未杂交的探针消化掉，从而使本底降低。1.探针的种类及其选择(3)RNA探针。mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的。另外，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶降解，很难操作，这也是限制其广泛应用的重要原因之一。1.探针的种类及其选择(4)寡核苷酸探针。近年来，随着DNA合成仪的问世及其使用的逐步推广，越来越多的研究者更热衷于采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；大多数寡核苷酸探针长度只有5~30bp，即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(Tm)，因此特别适合于基因点突变分析；另外，由于探针序列的复杂性降低，杂交所需时间也较短。2.各种标记物及其选择一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：①标记前后探针的基本结构不变，标记物不影响探针的化学性质、杂交特异性、Tm值等；②可以通过采取一定措施达到较高的灵敏度（如延长曝光时间或用增感屏来增加讯号的强度）；③特异性强、本底低，重复性好，并且操作简单、省时；④稳定、安全、经济、无污染。2.各种标记物及其选择目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性和非放射性两大类。1.放射性核素

放射性核素的灵敏度极高，可检测到10－4~10－18g的物质，但存在以下缺点：①容易造成放射性污染；②当标记活性极高时，放射线会造成核酸分子结构的破坏；③多数放射性核素的半衰期都比较短，必须随用随标记，标记后立即使用，不能长期存放（3H与14C除外）。2.各种标记物及其选择目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性和非放射性两大类。2.非放射性标记物生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、荧光素等多数非放射性标记探针的敏感性较差，但稳定性好、分辨力高、检测所需的时间短，尤其是操作过程中不需要放射性防护设备，在安全方面大大优于放射性标记探针。3.探针的标记方法放射性标记分为体内标记法及体外标记法两种，而基因工程中常用体外标记。体外标记法又分为化学法和酶法两种。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法标记是先将标记物标记在核苷酸上，然后在通过酶促聚合反应使带有标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生标记核酸探针。3.探针的标记方法常用的酶法标记有切口平移法（nicktranslation）和随机引物法（randompriming），这两种方法均为均一标记。此外还有一种是利用多核苷酸激酶的末端标记法，为不均匀标记。1.切口平移法2.随机引物法随机引物法优点：①模板的纯度不需很高即可标记；②反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量；③标记探针的比活较高，可达到4×109cpm/μg；④该法可以在低熔点的琼脂糖中进行。5’-端标记，标记物常用[γ-32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶5’-末端标记法3’-末端标记可使用末端转移酶，[α-32P]dNTP加到寡核苷酸的3’-末端，可以加上单个或多个标记物，多个标记物的加入可以提高探针的比活。3’-末端标记法4.非放射性标记探针的检出目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应结合的策略，杂交信号的检出依赖于酶反应，其中酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测。三、核酸杂交种类与方法（1）固相杂交，也称为膜上印迹杂交，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。（2）细胞原位杂交，标记已知序列的核酸，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。（3）液相杂交。1.固相杂交（膜上印迹杂交）膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。这种膜上印迹杂交的技术也称印迹技术。根据核酸分子的种类不同，印迹技术（或方法）分为Southern印迹和Northern印迹。根据核酸转移方式的不同也有不同的印迹方法：①斑点或狭缝印迹法；②虹吸转移印迹方法；③电转移印迹方法；④真空转移印迹方法。印迹杂交实验中，选择有效的转移方法和良好的固相支持物此项技术成败的关键。固相支持物种类很多，一种良好的固相支持物应具备以下几个特点：①具有较强的结合核酸分子的能力；②与核酸分子结合后，应不影响与探针分子的杂交反应；③与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作而不致于脱落或脱落极少；④非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；⑤具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。（1）固相支持物的选择（1）原理

Southern印迹是由Southern于1975年发明建立，是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。（2）Southern印迹杂交（2）Southern印迹杂交Northern印迹杂交是细胞总RNA或mRNA与DNA探针的杂交的印迹过程。（1）Northern印迹杂交的原理：提取植物总RNA或mRNA，用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，原位转移至固相膜，在适宜的离子强度及温度条件下，探针与膜上的同源序列杂交形成RNA-DNA杂交双链，通过探针的标记性质可以检出杂交体。根据杂交体在膜上的位置可进一步分析杂交RNA的大小。若经过上述杂交操作膜上没有出现杂交带，说明外源基因虽然已整合到植物染色体上，但在该取材部位及生理状态下并未有效表达。（3）Northern印迹杂交（2）Northern印迹杂交程序基本程序与Southern印迹杂交一样，只是电泳分离有较大差别，Southern印迹杂交是用普通琼脂糖凝胶分离DNA分子，而Northern印迹杂交则是用变性凝胶电泳来分离RNA分子。RNA电泳时必须注意两个问题：①防止单链RNA形成高级结构，所以必须采用变性凝胶；②电泳过程中始终要有效抑制RNA酶的作用。斑点杂交是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。（4）斑点杂交2.菌落原位杂交菌落原位杂交是DNA探针与菌落DNA的杂交，于1975年，由M.Grunsyein和D.Hogness提出。具体做法是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA与滤膜原位结合，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，故称为菌落原位杂交。3.组织原位杂交组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此组织原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第三节蛋白质组学与酵母双杂交随着人类基因组计划的逐步完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组研究是其中一个很重要的内容。蛋白质组学主要研究大系统或部分网络组成的多个不同蛋白质的相互作用关系，主要是鉴定系统的行为而不是任何单一组分的行为。根据蛋白质组学的研究内容可以分为：①表达蛋白质组学（expressionproteomics）：即研究细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱；②细胞图谱蛋白质组学（cell-mapproteomics）：即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。蛋白质组从整体的蛋白质水平上，更加深入、更加贴近生命本质的层次上去探讨和发现生命活动的规律。二、酵母双杂交技术（一）酵母双杂交的基本原理最早的酵母双杂交系统由Fields和Song等在研究真核基因转录调控中建立。采用转录激活因子单独的DNA结合区不能激活基因转录，但当DNA结合结构域与激活结构域物理性结合时，即能够发挥其转录激活功能。典型的真核生长转录因子如GAIA、GCN4等都含有两个不同的且相对独立的结构域：DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，DNA-BD)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain,AD)。二、酵母双杂交技术（一）酵母双杂交的基本原理前者可识别位于GAL4效应基因（GALL-responsegene）的上游激活序列（Upstreamactivatingsequence,UAS）并与之结合，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分相互作用，从而启动它所调节的基因的转录。即：DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。（二）酵母双杂交技术的应用酵母双杂交系统是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技术手段，已广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其他小分子间相互作用的研究，在蛋白相互作用图谱，多肽药物和寻找药物靶标，植物与病原物识别及抗病信号传导研究中也发挥了重要作用。1.建立蛋白相互作用图谱有科学家应用10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”，从含有约5×l06个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行多轮筛选，获得约700个阳性克隆，在这些筛选到的靶蛋白中，有9种是已知的mRNA前体剪接因子，5种是新发现的剪接因子，8种是与RNA其他加工过程有关的因子，还有45种与其他的功能有关。此外在以线虫的生殖发育过程为研究对象，利用已知的27个线虫发育相关蛋白建立了一个大规模的双杂交系统，获得了100多个相互作用的蛋白。由此可见，酵母双杂交技术为绘制生物体的蛋白质相互作用的网状图谱提供了条件。2.筛选多肽药物和寻找药物靶标利用双杂交系统可以确定治疗所用的多肽类药物与肿瘤、细菌以及病毒的蛋白质间的相互作用。因此，该技术已逐渐被应用于筛选新型的具有生物活性的肽类药物、诊断试剂和其他功能性多肽。我国学者通过将随机DNA片段与GAIA的AD融合构建酵母表达载体，成功构建了一个可筛选扩增的酵母双杂交随机肽库，用于筛选和设计靶蛋白相互作用的药物多肽。3.在植物与病原物识别中的应用4.在植物抗病信号传导研究中的应用利用酵母双杂交系统在以Pto抗病蛋白为核心的信号传导链中先后鉴定出多种重要的蛋白元件，已初步勾勒出了Pto抗病信号传导途径的线条。应用酵母双杂交系统可以从番茄基因文库中“钓”出了与Pto蛋白互作的蛋白Ptil。Ptil属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已经被证实是Pto蛋白激酶专一性磷酸化作用的底物。有学者利用酵母双杂交系统研究证实了Pto蛋白功能的发挥与另一个抗病蛋白Prf(具有NBS．LRR结构)密不可分，认为Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。二、基因敲除技术的应用基因敲除技术可以选择性地修饰基因及选择如何去修饰，最终完全控制该段基因的DNA序列或修饰其周围的调控元件。由于几乎所有生命现象均由基因控制或受其影响，因此，基因敲除技术在几乎所有生物学领域如微生物学、动物学、植物学、医学等领域都有应用价值。它目前已经广泛的应用于各个方面，并取得了较大的进展。第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第四节

基因敲除技术基因敲除（Knockout）又称为基因打靶，是指人为地从DNA分子水平上去除或替换某一个基因，使细胞内的某种特定遗传信息无法再表达，进而从整体水平或细胞水平推测相关基因功能的一种技术。基因敲除技术起源于20世纪80年代，是在基因同源重组技术和胚胎干细胞(EmbryonicStemcell，ES)技术的基础上建立起来的一种新分子生物学技术。基因同源重组技术是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，因此这种重组技术又称为同源重组。所谓胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Innercellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠子宫，该细胞能发育成胚胎的各种组织乃至于一个个体。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一特定位点上，以达到定点修饰改造染色体上某一目的基因的一种技术。它包括如下主要步骤：①构建重组载体；②重组DNA转入受体细胞核内；③筛选目的细胞；④转基因动物。这种方法的出现克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。该项技术的诞生是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景。一、Cre-LoxP基因敲除系统基因敲除的重组载体系统主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括：要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分；替换性载体系统主要包括：同源序列片段、替换基因的启动子和报道基因等成分。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，因为Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就能够发生在哪种组织细胞中。下面就Cre-LoxP基因敲除系统的基本原理做简要介绍。Cre-LoxP系统属于传统的同源重组载体,但是具有了时空调控的功能。它由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP（locusofX-overP1）序列同样来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。当两个loxP序列方向相同并且位于同一条染色体上时，Cre编码的重组酶蛋白能够将相同方向的loxP位点之间的核苷酸序列切除成为游离态，即有效切除两个loxP位点之间的核苷酸序列；当两个LoxP的序列相反时，Cre重组酶使两个loxP序列颠倒，并且这两种反应处于一种平衡状态；当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上面时，Cre重组酶能够介导两条DNA的交换或促使染色体易位。Cre重组酶能识别34bp的部分回文的loxP序列，介导LoxP的34bp重复序列的位点特异性重组,切除同向重复的2个LoxP位点间的DNA片段和1个LoxP位点，同时保留1个LoxP位点，从而使两个loxP位点之间的序列发生特异性的重组或删除。该特性从而使得Cre-Loxp系统广泛用于条件性基因敲除的研究。图11-4Cre-LoxP介导的基因表达启动或关闭机制Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在进行构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列用于基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。重组酶介导的盒式交换(recombinasemedi