WB-Protocol 免疫印迹实验方法总结(精华)

WB-protocol配液：1mol/LTris-HCl：12.114gTris-base，加水至100ml，PH6.81.5mol/LTris-HCl：18.7gTris-base，加水至100ml，PH8.810％SDS：5g电泳级SDS加水定容至50ml，可加热至68℃助溶Acrylamide<!>29g30%丙烯酰胺methylenediacrylamide<!>1g加水至100ml溶解，避光4℃保存{将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Pall滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。}10%AP：Ammoniumpersulfate10%(w/v)-20℃保存一个星期，一般一次配1ml。Glycine144g10×runningbuffer（1L）Tris-base30gSDS10g加水至1L1×runningbuffer（1L）:直接从10×runningbuffer加水稀释Glycine145g10×transferbuffer（1L）Tris-base29g加水至1L10×transferbuffer100ml1×transferbuffer（1L）methanol200ml加水至1LTris-base24.2g10×TBS（1L）Nacl80g36%Hcl约14mlpH调至7.6，加水至1L10×TBS100ml1×TBST（1L）Tween-200.5ml（即0.05%，临用时加入）加水至1L封闭液(5%)：也为抗体稀释液，5g脱脂奶粉溶于100ml1×TBST配制Glycerine2ml（20%）20×loadingbuffer(变性剂)bromophenolblue0.03%（适量）DTT0.3ml（3%）<!>4×uppertris7.7ml4×uppertris：Tris-base12.12g（0.5M）、10%SDS8ml，PH6.8，总计200ml1×samplebuffer：50mmol/LTris-HCl(PH6.8),20g/LSDS(电泳级)，10%GlycerolPonceauS丽春红:0.1%,0.1g溶于5ml冰醋酸;H2O至100ml，4℃保存。（可重复使用）DTT组份浓度：1MDTT

配制量：10mL

配制方法：

1.称取1.545gDTT，加入到15mL塑料离心管内。

2.加10mL的0.01M的NaOAc（醋酸钠）（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。

3.适量分成小份后，-20℃保存。

3M醋酸钠（NaOAc）（100ml）

1．称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。

2．加冰醋酸调节pH值至5.2。

3．定容至100ml，高压灭菌后室温保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

0.01MNaOAc(pH5.2)参照此配方配制。实验步骤一、蛋白样品制备培养细胞的蛋白质样品的制备（还没做过组织的，以后补充）a、收集：细胞培养至皿（100cm）上长满时，经PBS漂洗3次，加入1ml的1×samplebuffer,细胞刮收集，冰上操作，转移至离心管中，置-20℃保存。b、裂解：超声（超声5s间歇10s，功率100至120w）或注射器反复抽吸破碎，至细胞裂解液澄清不粘稠为止。置于冷冻离心机4℃25000g离心15min取上清；BCA（标准曲线）蛋白定量：准备蛋白标准品标准品的稀释（20–2,000µg/ml）VialH2O体积（ul）BSA体积（ul）BSA浓度A0100µlofStock2,000µg/mlB50150µlofStock1,500µg/mlC100100µlofStock1,000µg/mlD5050µlofvialBdilution750µg/mlE100100µlofvialCdilution500µg/mlF100100µlofvialEdilution250µg/mlG100100µlofvialFdilution125µg/mlH10025µlofvialGdilution25µg/mlI10000µg/ml准备工作液WorkingReagent(A:B=50:1)所需体积=(#standards+#unknowns)×(#replicates)×(volumeofWRpersample)c．操作步骤：1.吸取25ul标准品及待测样品到96孔板（复孔1个），sample/WR=1:8（如果样品量太少多，改为上10ulsample/WR=1:20，检测范围125-2,000µg/ml）2.加200ul的WR，摇床混匀1min；3．合上盖子在37℃孵育30min；4．冷却至室温，约20-30min5.在紫外分光光度计562nm下读数6.画标准曲线，算出待测样品浓度蛋白变性：在提取的蛋白中按每100ul加5ul20×loadingbuffer混匀后，置98℃水浴锅中煮沸10min使蛋白变性。若离心5min可以避免拖尾现象。二、制胶1、分离胶：一般来说，蛋白分子量越小需要胶的浓度越大，SDS分离胶浓度最佳分离范围（6%胶50-150Kd；8%胶30-90kD；10%胶20-80kD；12%胶12-60kD；15%胶10-40kD）按比例配制分离胶，轻缓摇动溶液8~9次，使激活剂混合均匀，配好后灌胶，然后用超纯水封胶。当水和胶之间有一条折射线时（约30min），就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。浓缩胶：沿玻璃板平缓注入凝胶溶液，然后保持水平插梳（上样孔不得留有气泡），静置30min后保证完全聚合。上样，依次加入蛋白marker和待分析样品，加样时间尽量短，避免样品扩散和边缘效应，可在未加样的孔中加入等量样品缓冲液。电泳加样完毕，盖好电泳槽盖子并选择适当恒压，一般浓缩胶80V，20min，分离胶120V，90min，电泳至溴酚蓝跑出凝胶末端处即可停止。（通电时，检查有否气泡产生）四、电转电泳结束后，取出凝胶，在预冷电转甘氨酸缓冲液中漂洗数秒；1、膜的预处理：按胶的大小剪下相应大小的PVDF膜（在右上角剪一个缺角，作为转膜时正面的标记，下方标注蛋白名称、日期）；将PVDF膜于甲醇中浸泡3-5min，放置于转膜液中；2、按胶的大小剪切转膜用滤纸，共6张，置于转膜液中浸湿5min；3、将浸透转移液的海绵、滤纸、PVDF膜和胶按下列顺序从下至上放置于湿转膜器中。从下至上为：夹子透明边-海绵－三层滤纸－PVDF膜－胶－三层滤纸－海绵-夹子黑色边。用玻璃棒轻轻碾压，挤出可能存在的气泡；放入转膜器（注意方向，PVDF膜对正极，胶对负极）；4、加入4℃预冷Transferbuffer，80mA恒流转膜（低温），分子量50KDa左右的蛋白用120min，20KDa左右的用90min。一般转膜电流200mA之间，时间30~60min或15~20mA过夜。大片段（>50KD）可选350mA，小片段可选250mA。滤纸最好不要比膜大，防止短路，各层之间无气泡。槽内夹子两旁放入冰袋。五、膜的封闭进行抗体杂交前需对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，取1×TBS漂洗3次×5min的转印膜，放入5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床震动，室温封闭1h。六、抗体杂交封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗，去除袋内所有气泡，封口，4℃孵育过夜或室温（22~25℃）摇动孵育1h，1×TBST洗膜3次×5min，加入5％脱脂奶稀释的HRP标记二抗（不能加叠氮钠，因为对过氧化酶有抑制作用）室温1h，1×TBST洗膜3次×5min。七、检测辣根过氧化物酶-ECL法增强化学发光（ECL）检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成不稳定的中间代谢物，其衰变时是在暗室里形成明显的肉眼可见的化学发光带，并可利用X光感光胶片记录发光结果，这里使用SuperSignalWestPico（Thermo）增强ECL发光剂，在暗室将杂交后印记膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，用纸巾吸去多余的显色液，加盖一透明玻璃纸并抚平，将印记膜在暗室中使胶片曝光不同时间，其间冲洗胶片以确定所测抗原的最佳曝光时间。化学显色，显影，定影（1）将显色发光剂A、B各取1滴（1:1混匀约共1.5ml）滴于PVDF膜上，反应2-3min后，用滤纸将PVDF膜边缘或者边角多余液体吸干，加盖一层透明玻璃纸并抚平，保证干的表面与胶片接触，在暗室中放置胶片，一旦放上，便不能移动，关上暗盒。（2）将显影液、自来水和定影液分别到入搪瓷盘中；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min；曝光完成后，打开曝光盒，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，自来水冲洗终止显影。显影时间一般为1～3min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，自来水中漂洗数秒，把X光片浸入定影液中，定影时间一般为1min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。WB试剂品名品牌规格价格代理备注甘氨酸amresco500g60博纳泰克丙烯酰胺amresco500g70博纳泰克甲叉丙烯酰胺amresco100g160博纳泰克过硫酸铵amresco25g200博纳泰克溴酚蓝amresco10g56.00博纳泰克二