橙油的致香物质分析与鉴别

橙油的致香物质分析与鉴别

橙色水果是生产橙色饮料的主要原材料。橙色皮和橙色核通过冷压法或蒸汽提取水分，即橙色油。橙油是三大果香香料之一,具有清甜的花香、橘香,常用于食品、饮料、牙膏、肥皂等的调香,在化妆品和医药中的应用也较为广泛。橙油中的萜烯、柠檬烯等还具有抗菌作用,以天然橙油作为食品的抗菌剂有助于提高食品的安全性。因此,分析橙油的致香物质对橙油的实际应用具有重要意义。GC-O技术经过半个世纪的发展,已成为香气分析领域一种重要的分析手段,广泛应用于食品、酒类饮品、乳制品、海鲜产品、环境监测等领域。常用的GC-O检测方法主要有三类:时间-强度法(time-intensitymethod)、稀释法(dilutionmethods)和检测频率法(detectionfrequencymethod,DF)。时间-强度法是在流出物出峰的同时记录感应到的气味强度,又称为OSME法。以保留时间为横坐标,香气强度为纵坐标作图,化合物气味强度越大,其对香气整体贡献就越大。稀释法分为芳香物萃取稀释法(aromaextractdilutionanalysis,AEDA)和Charm分析(combinedhedonicaromaresponsemeasurementanalysis),AEDA法是根据每种化合物的香气稀释因子(flavordilutionfactor,FD)大小来判断化合物对香气贡献的大小。具体为将样品按一定比例逐级稀释,并进行GC-O分析,直到嗅辨员无法感知化合物气味时的浓度下化合物的稀释倍数即为其FD因子,以保留时间为横坐标,稀释因子为纵坐标作图,一般地,FD因子越高,对化合物香气贡献越大。检测频率法是最简单的GC-O方法,但需要大量嗅辨员重复多次实验,消耗人力、时间较多。多人多次对同一个样品进行GC-O分析,统计每个香气出现的频率,以保留时间为横坐标,DF值为纵坐标作图,化合物香气被检测到的频率越大,对整体香气贡献越大。国外一些研究者对不同橙油的香气成分进行了研究。Hognadóttir等报道了热浓缩橙汁产生的橙油(美国奇华顿风味香精公司)香气实际上只由其相对质量分数不到4%的挥发性成分产生,这些香气成分为辛醛、4-松油醇、芳樟醇、(E,E)-2,4-癸二烯醛等。Choi对金橘皮精油的香味成分进行分析,GC-MS和GC-O结果表明,柠檬烯是金橘皮精油中相对质量分数最多的化合物,但其对整体香气贡献不大,而莰烯、4-萜烯醇、甲酸香茅酯、乙酸香茅酯虽然相对质量分数较低,却为主要香气贡献物。FD因子、RFA(relativeflavoractivity)和嗅闻结果都证实甲酸香茅酯、乙酸香茅酯为金橘皮油的特征香气成分。Dharmawan等采用GC-O和AEDA法结合分析了坤甸(印度尼西亚中部港市)橙皮精油,鉴定出了41种香味物质,AEDA法的结果表明,FD因子最大的物质为α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、2-甲氧基-3-异丁基吡嗪以及两种未知物质。不同时间、产地的橙油以及制备工艺不同均会导致致香成分的差异,因此,本文通过时间强度法和AEDA法相结合对橙油的香味活性物质进行分析,建立了快速、准确鉴定精油致香物质的方法,对提高橙油在食品、饮料、烟草等领域中的应用效率具有重要实际意义,同时该分析方法对其他香精香料的致香物质检测分析、调配机理研究等也具有一定参考价值。1实验部分1.1gerstrodp2嗅仪Agilent7890-5975气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司);HP-5MS毛细管柱(30m×250μm×0.25μm,美国安捷伦公司);GerstelODP2嗅觉测量仪(德国Gerstel公司);加湿器(德国Gerstel公司)。高纯氮气(体积分数99.999%,上海比欧西气体工业有限公司);高纯氦气(体积分数99.999%,上海比欧西气体工业有限公司)。橙油(DanielHE,BelasisAvenueBillinghamClevelandTS231LQEngland),质量分数5%;无水乙醇(质量分数99.7%,常熟市杨园化工有限公司)。1.2条件11.2.1.2温度条件色谱进样口温度250℃;进样量:1.0μL;载气:He(1.0mL/min,恒流);分流进样,分流比10∶1;升温程序:初始温度40℃,以10℃/min升到80℃(保持1min),然后以10℃/min升到240℃(保持10min)。离子源:EI源,温度:230℃;传输线温度:240℃;扫描方式:Fullscan;扫描范围:35~300amu。1.2.2测量的觉醒ODP传输线温度为220℃;在嗅觉端口处对气体进行加湿,补充气体为氮气。1.3嗅辨剂的检测在样品经色谱柱分离后,以大约1∶1的比例分别进入质谱检测器和嗅觉端口。嗅辨员在ODP端口进行气味分析,主要评价气味的香气类型、香气强度、持续时间,每个样品进行3次重复嗅闻,取平均值。嗅辨员经过半年嗅觉训练,熟知各种物质的气味,并且积累了大量专业词汇。在两次评价之间至少要休息30min。时间-强度法测试时嗅辨员需要描述香气类型、强度和持续时间,香气强度采用五级气味强度法。样品无需任何处理直接进样。AEDA法测试时将样品以无水乙醇分别稀释20、40、60、80、100、120倍,进行GC-O检测,稀释倍数为嗅辨员不能闻到化合物香气为止。样品进样量为1μL。1.4气相色谱质量分析的结果采用NIST08、Wiley7谱库检索相结合进行定性,面积归一化法定量计算各物质的相对质量分数。2结果与讨论2.1香气强度法检测金属酶的含量通过GC-MS检测到橙油中有35种挥发性物质(图1a,表1),包括11种萜烯类,12种醛类,8种醇类,2种酸,2种酮,其中相对质量分数较高的挥发性化合物为:柠檬烯(80.79%)、芳樟醇(3.85%)、癸醛(2.90%)、β-月桂烯(1.94%)、α-蒎烯(0.82%)、辛醛(0.71%)等,这与其他文献报道相一致。通过GC-O检测到8种香气物质,分别为:α-蒎烯(青香)、辛醛(皂香)、柠檬烯(花香、橘香)、芳樟醇(青香、果香)、α-松油醇(柠檬味、酸)、癸醛(皂香、果香)、肉豆蔻醛(杏仁、脂肪)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(干草气息)及一种未知物质(花香、甜、橘香)。由图1b可知,α-蒎烯、辛醛、癸醛、肉豆蔻醛及(E,E)-2,4-癸二烯醛的香气强度值为2(可以感知并分辨出何种气味),香气持续时间较短。在Hognadóttir的研究中α-蒎烯和(E,E)-2,4-癸二烯醛香气强度中等,辛醛香气强度最大。而肉豆蔻醛在其他文献鲜见报道。芳樟醇的香气强度值为3(能明显感觉到气味)且香气持续时间较长,与Hognadóttir的研究相一致。香气最强烈(强度值为4)的是α-松油醇和未知物质,由强度法可以初步判断这两者为橙油的主要致香物质。α-松油醇的香气强烈、刺激但持续时间很短,说明α-松油醇留香值较小,而Hognadóttir的研究中并未感知到α-松油醇,但其检测到香气强度较大具有木香的4-松油醇。Choi则检测到了这两种物质。未知物质的香气柔和、透发且持久,具有橙油的特征香气,且留香值较大,说明未知物质在整体香气中贡献较大。强度法是基于香气实际强度的评估方法,可同时提供香味活性物质的香气强度和香气持续时间。但是强度法评价持续时间的重复性要低于强度值重复性,因此,单靠强度法进行判断是不充分的。物质气味强度和浓度之间存在一定关系,Kamadia等采用稀释法证实了物质气味强度和浓度之间满足Steven′sLaw定律。因此,稀释法可以弥补强度法的缺陷,二者优势互补,更有利于把握橙油中的关键致香物质。由稀释色谱图(图1c)可以看出,此法判定的致香物质与强度法相吻合。FD因子最大(120)的化合物是具有柠檬、果酸香味的α-松油醇和清甜花香、橘香的未知物质,二者在极度稀释的情况下仍可提供强烈的香气,说明对橙油的香气影响非常大。Choi等人认为α-松油醇具树脂味,且其FD因子值较小,对整体香气贡献不是太大;而在本实验中,α-松油醇具有强烈的柠檬果香和果酸味,与橙油的头香果香味很相似。未知物质的清甜花香、橘香,与橙油特征香气清甜花香、果香非常相似。柠檬烯和α-蒎烯相对质量分数虽然较高,但FD因子(20)较小,说明其对橙油整体香气影响较小。Choi和Dharmawan的研究中柠檬烯相对质量分数最高,但FD因子不是最大,Song的研究中柠檬烯相对质量分数最大且具有较大的FD因子。此3人的研究中α-蒎烯FD值均较大,Dharmawan等人的研究认为,α-蒎烯是FD因子最大的化合物之一。辛醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛的FD因子中等(40),且随着浓度的不断减小其香气呈迅速减弱趋势。Choi等并没有检测到辛醛具有香味,而Song的研究中辛醛具有较大的FD因子;Dharmawan的研究中(E,E)-2,4-癸二烯醛具有油脂味,其FD值也相对较小。芳樟醇、癸醛和肉豆蔻醛的FD因子(60)比辛醛大,在较低浓度下其香气依然比较明显,对橙油的整体香气影响较大,而且芳樟醇表现出气味特征随着浓度的变化而改变,在低浓度下呈现果香和青香,随着浓度增加就逐渐呈现浓郁青香。Choi的研究认为芳樟醇具有果香,FD因子较小,对整体香味影响并不突出;而Dharmawan则认为芳樟醇是FD因子最高的化合物之一;Song等也认为芳樟醇的FD因子较高。2.2关键致香物质的确定由于物质特性不同,不同类型的色谱柱对物质的分离能力有所差异。未知物质的香气持续时间为14.0~15.6min,对此时间段内出峰的化合物进行图谱放大仔细检索分析(图2,表2),并查阅相关文献发现:可巴烯具有清新、甜、柚子香气,十二醛具有柠檬、橘香、青香香气,柠檬醛二乙醇缩醛具有柔和而新鲜的柑橘果香,又带有香果。由于这些物质出峰较近,嗅辨员在此处嗅闻到的香气可能是这些物质的气味的混合,也可能是某种阈值很低的化合物。因此,要进一步深入确定这种气味所对应的化合物,还有待采用多维气相色谱技术来进行分析。由以上分析可知,各化合物是否是关键致香物质,不能仅靠单一方法来进行判定,如:强度法研究表明,芳樟醇的香气持续时间较长,可能对橙油整体香气贡献较大,但是稀释法表明,随着浓度的降低,芳樟醇香气强度呈迅速减弱趋势,所以,在浓度极低时,芳樟醇对整体香气的影响可能是极小的甚至没有影响。因此,稀释法与强度法结合可以更有效地鉴别精油的