当归四逆汤口服对大鼠血清中阿魏酸血药浓度的影响

当归四逆汤口服对大鼠血清中阿魏酸血药浓度的影响

当归四逆汤来自“伤寒论”，由当归、白芍、桂枝、细辛、甘草、通草、大枣等七味药物组成。该方温经散寒、养血通脉,具有扩张血管,改善微循环,降低血液黏稠度,抗凝、抗炎、镇痛,改善心肌血氧供应等作用。临床主要用于血虚寒厥证,治疗雷诺氏病、冠心病、糖尿病下肢动脉硬化闭塞症等。有报道证实在该方乙醇提取液中含有阿魏酸,而阿魏酸具有强抗氧化能力及清除自由基作用,对于冠心病和一部分癌症有治疗作用,可能是当归四逆汤治疗作用的其中一个重要的物质基础。但在当归四逆汤水煎剂中是否存在阿魏酸,该方口服后血清中是否也含有阿魏酸,经当归四逆汤配伍应用后阿魏酸的血液动力学有何改变,均值得探讨。为此,本实验探究当归四逆汤水煎剂中是否也含有阿魏酸及当归四逆汤水煎剂大鼠灌胃后其中成分阿魏酸是否入血及其药代动力学规律。1仪器和实验材料1.1旋转蒸发仪Agilengt1200高效液相色谱仪(美国Agilent),RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),BS110型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。1.2药物饮片来源甲醇、乙腈均为色谱纯,正丁醇,冰醋酸为分析纯,实验用水为三重蒸馏水,阿魏酸标准品(批号:ZL20090425AWS)购自南京泽朗医药科技有限公司,当归四逆汤(当归、白芍、桂枝、细辛、甘草、通草、大枣等按4∶3∶3∶1∶2∶2∶1比例混合)药物饮片购自广东中医药大学第一附属医院。当归四逆汤按照中药煎药常规煎,经减压旋转浓缩成每毫升相当于1g生药的混悬液。1.3实验动物SD大鼠,250~300g,♀♂各半,由南方医科大学动物实验中心提供。2方法2.1日基本国家教育42只SD大鼠,随机分成7组,灌胃后30、60、90、120、180、360、540min共7个时间点腹主动脉取血,每个时间点为一组,每组6只,♀♂各半,于灌胃前一天晚上禁食,饮水不限。按20g/kg灌胃给予当归四逆汤水煎液,具体方法:腹腔注射2%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉动物,每只大鼠开腹,于腹主动脉取血5~6mL,置于离心管内,静置1h,离心(4000r/min,15min,6℃),弃去沉淀,取上清液2mL,加正丁醇8mL,混匀3min,加乙酸20μL,离心4000r/min,25min,4~6℃,取上清液于尖底离心管中40℃水浴,氮气吹干,1mL甲醇定容,并微孔滤膜过滤,10μL进样。2.2标准曲线的绘制利用二甲基亚砜溶解阿魏酸,并配成50mmol/L贮备液,从标准贮备液中取阿魏酸,取4个浓度点(2×10-5、4×10-5、2×10-5,8×10-5,16×10-5mol/L)绘制标准曲线,上述标准品加空白血清2mL,加正丁醇8mL,混均3min,加乙酸20μL,离心4000r/min,25min,4~6℃,取上清液于尖底离心管中40℃水浴氮气吹干,1mL甲醇定容,并微孔滤膜过滤,10μL进样。2.3柱温25m色谱柱:CapcellPAKC18size250mm×4.6mm,TYPEMGⅡ5μm,柱温20℃。梯度洗脱见表1,流速为1.0mL/min,检测波长有230nm、275nm、254nm、320nm,进样量10μL。3阿魏酸的药代动力学当归四逆汤水煎剂经正丁醇萃取后,经高效液相色谱法测定发现在检测波长320nm图谱上存在阿魏酸峰,按前述样品处理方法处理标准品,经HPLC测定(见图1)标准品阿魏酸面积(Y)并计算Y对阿魏酸血药浓度之间的回归方程,方程为Y=5.141+3.62X,r=0.9987,P<0.01(Y为阿魏酸峰面积,X为阿魏酸浓度,单位为10-5mol/L),样品及空白血清经上述方法处理,经HPLC测定,图谱见(图2、3)根据标准曲线,算出样品中的阿魏酸的浓度结果,见表2,并绘制出阿魏酸浓度对于时间的曲线,见图4,上述浓度数据使用药代动力学计算程序(3P97)进行曲线拟合,得出大鼠口服当归四逆汤后,其有效成分阿魏酸的药代动力学参数见表3,统计矩结果见表4,结果表明当归四逆汤口服后,其中阿魏酸有效成分在大鼠体内的药时过程符合一室模型(根据最小AIC准则)权重1/C2,Cmax7.988771mg/L,AUC7861.50780mg/(L·min),总体表现为口服后吸收快,消除慢。4逆汤药物作用阿魏酸具有抗氧化和抗自由基活性,当归四逆汤乙醇提取液含有阿魏酸,但是该方水煎剂是否还含有阿魏酸尚未见报道。本实验结合文献报道的阿魏酸的高效液相色谱梯度洗脱程序最后采取了表1程序,通过高效液相色谱(HPLC)首次发现当归四逆汤水煎剂在320nm波长的图谱上含有阿魏酸(有研究发现320nm波长比较适合阿魏酸检测,试验中证实了这一点)而且口服当归四逆汤水煎剂后大鼠血清中也存在阿魏酸,说明阿魏酸应是当归四逆汤的一个有效成分,阿魏酸单体及当归、川芎等单味药中的阿魏酸在不同动物及人体的药动学已有少量报道,多为一室模型,口服给药后血药浓度下降迅速,部分复方中阿魏酸口服后体内分布与代谢为二室模型,本实验发现给大鼠口服当归四逆汤后阿魏酸的药代动力学为Cmax7.988771mg/L,AUC7861.50780mg/(L·min),在大鼠体内的药时过程符合一室模型(根据最小AIC准则)权重1/C2,口服吸收快,但是消除慢,与