四逆汤临床煎煮工艺优化研究

四逆汤临床煎煮工艺优化研究

四逆汤是“伤寒论”的经典方剂，由生附子、干姜和炒甘草（蜜炒）组成。具有加热和去寒回阳、救逆的功效。现代药理研究表明该方具有强心、抗休克、增加冠脉血流量的作用,是临床上常用的抗休克中药方剂之一。中国药典2010年版(一部)所收载四逆汤含量测定项下,仅检测甘草酸单一指标性成分,针对此,笔者前期利用高效液相色谱法建立与完善了可以同时检测汤剂中苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚等4种成分的质量控制方法。本文通过单因素试验,以汤剂中苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚等4种成分含量及浸膏量为指标,分别对浸泡时间、煎煮时间、加水倍量、煎煮次数进行考察,并设计L9(34)正交试验进行优化,寻找四逆汤临床煎煮的最佳工艺,为有效控制汤剂质量与临床疗效提供实验基础。1设备和材料1.1实验仪器1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AG285型电子分析天平(瑞士MettlerToledo公司);DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)。1.2对照品及试剂四氢呋喃和甲醇均为色谱纯(美国Tedia公司),磷酸和乙酸铵为分析纯(南京化学试剂有限公司),水制备自EPED-10TF型超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司),其余试剂均为分析纯。苯甲酰新乌头原碱对照品购自成都瑞芬斯生物科技有限公司(质量分数不低于98%,批号:RFS-B-10-07-13);甘草苷(批号:1321)、甘草酸铵(批号:1298)和6-姜酚(批号:1263)对照品均购于上海施丹德生物技术有限公司(质量分数不低于98%)。附子(批号:110217)、炙甘草(批号:110304)、干姜(批号:110224)均由南京海昌中药集团有限公司提供,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定均为正品,且检测结果均符合中国药典2010年版(一部)的要求。2方法2.1n离心15min精密吸取汤剂样品8mL,置于离心机4000r/min离心15min。再精密量取上清液2mL,用甲醇定容至5mL,充分混匀,醇沉液于离心机16000r/min离心15min,0.45μm微孔滤膜过滤,备用。2.2对照品溶液的制备分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸铵和6-姜酚对照品适量,用甲醇配制成苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚浓度分别为0.12、0.42、0.24、0.36mg/mL的混合对照品储备液,备用。2.3生长曲线lm色谱柱:ThermoHypersilBDS(4.6mm×250mm,5μm)。流动相:乙腈-四氢呋喃(25∶15,A)和0.1mol/L醋酸铵水溶液(每1000mL含H3PO40.5mL,B),梯度洗脱,15%→26%A(0～48min),26%→35%A(48～49min),35%A(49～65min);流速1.0mL/min;检测波长235nm;柱温25℃。3结果与分析3.1标准系列溶液的配制取含有苯甲酰新乌头原碱、甘草苷、甘草酸和6-姜酚的混合对照品储备液,用甲醇稀释成标准系列溶液。在实验条件下进样10μL,测定各色谱峰峰面积,以对照品浓度(mg/mL)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标进行线性回归,结果见表1。3.2单因素试验3.2.1浸泡时间对各成分的可制性的影响在加水量为20倍量,煎煮60min,煎煮2次的条件下,分别考察浸泡0、20、30、60、90及120min对各成分煎出率的影响,结果在0～90min内随着浸泡时间增加,各成分的煎出率升高,随后降低。故将正交设计试验中浸泡时间因素考察水平定为:30、60、90min。3.2.2不同蒸煮时间对各成分的部分回收工艺的影响在加水量为20倍量,浸泡30min,煎煮2次的条件下,分别考察煎煮20、30、40、60、90及120min对各成分煎出率的影响,结果煎煮时间超过60min后,随着煎煮时间增加,各成分的煎出率降低,故将正交设计试验中煎煮时间因素考察水平定为:30、40、60min。3.2.3加速度倍量的影响在浸泡时间30min,煎煮时间30min,煎煮2次的条件下,分别考察加水5、10、15、20、25、30倍量对各成分煎出率的影响,结果当加水倍量在5～20倍时,随着加水倍量的增加,各成分的煎出率增加,之后再增加无明显变化。故将正交设计试验中加水倍量因素考察水平定为:10、15、20倍。3.2.4煎煮次数的影响:在浸泡时间为30min,加水倍量为20倍量,煎煮时间30min的条件下,分别考察煎煮1、2、3、4、5、6次对各成分煎出率的影响,结果煎煮次数超过3次以上时,各成分的煎出率几乎不再增加,结合实际操作,将正交设计试验中煎煮次数考察水平定为1、2、3次。3.3正交试验3.3.1最佳制备工艺的确定在单因素试验的基础上,考察浸泡时间(A)、煎煮时间(B)、加水倍量(C)、煎煮次数(D)对各成分煎出率与浸膏重量的影响,每种因素考察3水平。按L9(34)正交表进行试验,探讨最佳煎煮工艺。因素水平表见表2。3.3.2正交试验结果由表4可知,因素D为影响甘草苷煎煮含量的最主要影响因素;因素A、B对甘草苷的煎出没有明显影响;A为误差项。可以看出各因素的影响大小是D>B>C>A,最佳工艺为A2B3C1D2。由表5可知,因素A、C对苯甲酰新乌头原碱的煎出没有明显影响;因素D有显著性影响;B为误差项。可以看出各因素的影响大小为D>A>C>B,工艺为A2B3C1D2时所得苯甲酰新乌头原碱的含量最高。由表6可知,因素B、C对甘草酸的煎出无显著影响;因素D为影响甘草酸煎煮的最主要影响因素。各因素的影响大小为D>C>B>A,最佳工艺为A2B3C1D2。由表7可知,因素A、C、D对6-姜酚的煎出率没有显著性影响,B为误差项。各因素对6-姜酚的影响强弱为:D>C>A>B,最佳工艺为A2B3C1D2。由表8可知,因素A、B对浸膏重量没有明显影响;因素D对浸膏得率有显著影响;C为误差项。在工艺为A2B3C1D2时所得浸膏重量最大。综合各项指标,通过以上正交试验得到的最佳提取工艺为:A2B3C1D2,即浸泡时间为60min,煎煮时间为60min,加水倍量为10倍,煎煮2次。验证试验的结果见表9。4不同单次最佳临床煎煮工艺的确定本实验通过单因素试验分别考察浸泡时间、煎煮时间、加水倍量、煎煮次数对四逆汤中4种成分煎出率的影响,并通过正交试验结合实际应用,得出煎煮次数是影响甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、甘草酸