心肌细胞的定向流变性钾通道

心肌细胞的定向流变性钾通道

大厅特征是描述不同方向上某一特定的物理名称。从广义上讲,离子通道也是一种导体,且离子从膜两侧向对侧的通透程度也可能不尽相同,故将“整流”引用到描述通道传导离子能力的门控动力学特点上来。心肌细胞钾离子通道(钾通道)都具不同程度的整流特性。其中一类钾通道对K+内流的通透程度大于K+外流的通透程度。表现在:当膜电位处于反转电位以下时,内向K+流随膜电位超极化程度加大而增加;当膜电位处于反转电位以上时,外向K+流随膜电位去极化程度加大而减小。这种现象称为反向整流(anomalouslyrectifying)或内向整流(inwardlyrectifying)。这类钾通道也被命名为内向整流性钾通道(inwardlyrectifyingK+channels,Kir)。自1993年Kir1.1和Kir2.1被克隆以来,许多具有内向整流特性的钾通道被不断发现。根据通道的功能特点及氨基酸序列,可将现有的Kir家族分为七种类型:Kir1~Kir7。有些同类Kir通道因为存在RNA剪接的差异(splicingvariance),又再可分为多种亚型(表1)。在心肌细胞膜上,存在三种重要Kir:经典Kir(classicinwardrectifierK+channel,IRK1)、ATP-敏感性钾通道(ATP-sensitiveK+channel,KATP)和乙酰胆碱敏感性钾通道(acetylcholine-sensitiveK+channel,KAch)。笔者就这些心脏Kir的功能和结构特点,及和这些通道活性异常有关的心脏疾病作一简要介绍。1irk1的生理作用IRK1基因编码:KCNJ2。心脏型为Kir2.1亚型。IRK1属强Kir,其电流又称为IK1或钾背景电流。IRK1在心肌细胞膜上密度极高。因此总电流较大。由于细胞膜存在“漏电流”(如Na+-Ca2+交换电流等),实际上IRK1通道的反转电位较K+平衡电位或细胞膜静息电位稍高(负值较大)。因此,在静息膜电位水平,IRK1表现为一定的外向电流。但这微弱的外向电流在膜电位进一步去极化后趋向为零(即强内向整流性)。所以,IRK1内向整流的生理作用主要体现在静息电位水平附近。它们是:①一定的外向电流可将膜电位钳制在较负水平(-70~-80mV),有助膜电位的稳定;②一定的外向电流可使动作电位时程缩短(主要发生在接近静息电位水平的3相动作电位末期)。动物实验证明,过度表达非功能性IRK1可减慢动作电位复极和促进膜电位去极化。另外,新近研究发现,IRK1通道可在心脏缺血缺氧早期被激活,进而缩短动作电位时程,减少Ca2+内流,防止心肌细胞内Ca2+超负荷,具有一定的心肌保护作用。1.1irk1通道与Kir家族所有的通道一样,功能性Kir2.1通道由四个互不相连的孔道构成蛋白Kir2.1亚基单体(~48kDa)组成。每一Kir2.1亚基单体只含两个跨膜区段(M1、M2)。M1与M2之间的膜外连接链向通道孔内延伸,形成内孔环链,称为H5。H5环链上含有三个重要氨基酸GYG,为K+选择器,是所有钾通道的共同结构。N-末端与C-末端位于胞浆面。四个M2和C-末端分别构成离子渗透孔道胞膜段与胞浆段的内衬(图1左)。IRK1通道强内向整流作用的分子机制已基本明确。主要是由于细胞内Mg2+和内源性多聚胺(polyamine)或称精氨(spermine,SPM)的带正电荷物质与通道内孔带负电荷氨基酸结合,特别是与M2上的天冬氨酸(D172)和C-末端的谷氨酸(E224和E299)结合,产生类似筏门样阻碍机制(图1右)。即仅阻塞K+外流,而不影响K+内流,从而产生内向整流作用。如将这些负电荷氨基酸改变,IRK1内向整流的作用明显减弱。但必需强调,在其它Kir家族成员中,M2和C-末端带负电荷氨基酸的多少与通道内向整流程度基本无关。例如,Kir7.1为弱内向整流,但其M2和C-末端却带有多个负电荷氨基酸;而Kir3.2呈强内向整流,其M2和C-末端缺乏负电荷氨基酸。Mg2+和多聚胺似乎对这些通道的内向整流作用影响也不大。Pegan等在研究Kir2.1和Kir3.1蛋白晶体结构后发现:Kir2.1通道最狭窄部分在孔道胞膜部与胞浆部交界处,直径约3Å,称为门控环(G-loop)(图1左)。改变门控环附近的部分氨基酸电荷量或侧链大小,可使内向整流作用发生变化。1.2irk1对ba2+敏感检测方法IRK1电流无时间、无电压依赖性激活与失活过程,故称钾背景电流。从理论上讲,只要存在K+浓度梯度和电压梯度,在任何反转电位以下的膜电位,都能记录到IRK1内向电流。只是由于驱动电压不同,内向电流大小不一。IRK1对Ba2+敏感,其电流的单通道及全细胞记录方法可根据程序刺激的不同,分为阶梯式(step)程序刺激和斜面式(ramp)程序刺激记录。前者可详细观测电流的时间依赖性、电压依赖性激活和失活过程;后者可粗略评估通道的电流-电压关系。因为IRK1通道不存在时间和电压依赖性激活与失活过程,斜面式程序刺激不失为高效、简捷的测试方法。必需指出的是:在记录钾背景电流时,不宜用P/N程序进行膜电容及漏电流减除,以避免产生“伪电流”。图2为大鼠心室肌IRK1电流单通道及全细胞记录。2u3000kirt-pcr的设计与研究功能性KATP通道是四个互不相连的孔道构成亚基(Kir6)和四个磺脲类受体(SUR)组成的蛋白八联体。Kir6几乎无法在细胞膜上单独表达。现已发现,Kir6亚基C-末端存在RKR区段,为内质网滞留(retention)信使。其功能是防止蛋白质从内质网向细胞膜转运(trafficking)。功能性KATP通道蛋白的细胞膜表达必需将Kir6的C-末端最后26个氨基酸(含RKR区段)切除,或与磺脲类受体(sulphonylureareceptors,SUR)以4∶4的方式共同表达(图3)。巨大的C-末端能将Kir6的RKR区段覆盖,从而丧失其内质网滞留功能,使之能够细胞膜表达。SUR虽然也含RKR内质网滞留信使结构,但它的功能不全,不足以单独影响SUR的细胞膜表达。KATP通道为弱Kir,在许多细胞膜上广泛表达,并参与调节神经元神经冲动的发放、胰β-细胞胰岛素的分泌和心脏的电兴奋。药理学实验提示线粒体膜上也可能存在KATP通道,但至今仍缺乏令人说服的分子生物学、电生理学证据。与IRK1一样,KATP对心肌细胞膜电位和动作电位时程的稳定起重要作用。在正常情况下,心肌细胞内ATP合成充足,KATP通道关闭。一旦心肌细胞缺血缺氧,ATP合成不足,KATP通道激活。KATP通道开放使K+外流增加,缩短动作电位时程,减少Ca2+内流,防止心肌细胞内Ca2+超负荷。因此,心肌细胞KATP通道活性对调节心肌细胞兴奋-收缩藕联具重要作用,不仅是药物治疗心律失常、心力衰竭的靶蛋白,也是心肌保护、心肌缺血预适应(myocardialischemicpreconditioning)机制的理论基础。目前还认为KATP通道是心脏的能量感受器,能合理调节心脏对外界应急反应的适应能力。实验证明KATP通道可通过调节心肌细胞内Ca2+浓度,使心脏适应在机体应急或运动条件下所增加的生理需要。Kir6.2基因剔除的小鼠对运动和去甲肾上腺素诱发的应急反应能力明显不如正常小鼠。这些基因剔除小鼠心肌细胞内,Ca2+超负荷、线粒体损伤严重,动物死亡率明显增加。2.1不同组织的tatp基因Kir6(37~50kDa)和SUR(160~175kDa)基因各有两种类型:Kir6.1、Kir6.2和SUR1、SUR2。根据对磺脲类药物的敏感性,SUR1为高亲和力受体(Kd≈1nmol/L);SUR2为低亲和力受体(Kd≈1μmol/L)。又根据RNA剪接差异,SUR2可再分为两种亚型:SUR2A和SUR2B。不同组织的KATP通道,其Kir6与SUR的组合不同。在心肌细胞,主要为Kir6.2/SUR2A组合。最近发现,在心房肌上还存在少量Kir6.2/SUR1组合。这种组合具体有什么特殊生理和病理学意义,仍有待研究。这里仅以Kir6.2/SUR2A组合为例,进一步说明KATP通道的功能与结构关系。2.1.1跨膜片段胞浆第34和meadp2的晶体结构及机制ABCC9,位于人染色体12p12.1。SUR2A不仅直接影响Kir6.2亚基的表达,而且还参予Kir6.2的功能调节。SUR2A结构复杂,含三组跨膜区间,共有17个跨膜区段(图3)。其中,TMD0,内含5个跨膜区段;TMD1和TMD2跨膜区间各包括6个跨膜区段。每一跨膜区段之间有多肽连接链相连。在TMD1和TMD2之后的连接链上,有两个核苷酸结合折叠处(nucleotide-bindingfolds,NBF1和NBF2)。每个NBF各含一对WalkerA和WalkerB区段,为核苷酸结合位点。现已证明,ATP结合在NBF1;而MgADP结合在NBF2。其中,MgADP与NBF2结合后还能防止ATP在NBF1处的结合。这就是为什么ATP能抑制KATP通道,而MgADP则激活KATP通道的原因之一。因此,胞浆内ATP/ADP浓度比例对KATP通道活性调节起决定性作用。另外,NBF2还是ATP酶,具水解ATP的功能。在TMD0和TMD2的第3~4跨膜区段胞浆面连接链上,各有一处磺脲类受体阻断剂(如glyburide)结合位点。在TMD2胞浆侧,还有两处K+通道激活剂(如diazoxide)作用位点(图3)。抑制或增强SUR的功能,也间接影响KATP通道的活性。2.1.2u3000ki-sart2a的激活作用KCNJ11。结构与Kir2.1相仿,兹不多述。这里着重介绍一些与KATP通道功能调节有关的结构。现已证明,将Kir6.2最后26个氨基酸切除(Kir6.2ΔC26),Kir6.2ΔC26亚基可单独表达。同时还保留它对ATP的敏感性。在Kir6.2ΔC26通道上,发现许多影响ATP敏感性的氨基酸位点,包括:R27、R50、C166、I167、T171、R176、R177、E179、I182、K185、R201和G334等。但在这些氨基酸中,只有R50、K185、R201和G334是ATP真正结合位点。R50、K185、R201和G334共同形成一个ATP结合槽。利用光敏感或放射性ATP标记技术结合膜片钳技术证实,R50,K185、R201分别与ATP之γ、β和α位磷酸键结合;G334与腺嘌呤结合。改变这四个氨基酸的电荷量和侧链大小可使通道对ATP的敏感性极大降低,甚至消失。其它氨基酸是通过改变ATP结合槽的三维空间结构而间接影响通道对ATP的敏感性。另外,共同表达SUR能增加通道ATP结合槽的宽度,从而加强腺嘌呤与ATP结合槽的结合能力。除了ATP/ADP的调节外,4,5-二磷酸肌醇(PIP2)和长链乙酰辅酶A脂(longchainacyl-CoAesters)也能激活KATP通道,并逆转ATP对Kir6.2电流的抑制作用。PIP2和长链乙酰辅酶A脂为一端疏水另一端亲水的极性分子。其疏水端相嵌在细胞膜上,亲水端与Kir6.2通道蛋白的R54、R176、R177和R206结合。这些氨基酸距ATP结合槽很近,从而与ATP竞争同一结合位点。花生四烯酸的P450环氧酶代谢产物:环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,EETs),也有很强的KATP通道激活作用。在心肌缺血-再灌注时,EETs的生物合成明显增高。我们在膜片钳实验上首先发现,EETs具很强的心肌及血管平滑肌KATP通道激活作用。最大半效浓度(EC50)为10-9mol/L左右。随后的动物实验也证明,实验前给予EETs能明显缩小心脏缺血-再灌注造成的心肌梗死面积和再灌注损伤,其心脏的保护作用能被KATP通道抑制剂阻断。不同组织KATP通道,EETs的作用机制可能不同。对心肌KATP通道而言,它们能与Kir6.2亚基上R192、R195结合,通过改变ATP结合槽的三级构象,从而减弱ATP与Kir6.2的结合能力,进而降低ATP对通道的抑制、增强通道的开放概率。血管平滑肌KATP通道为Kir6.1/SUR2B组合。需要ADP和UDP激活。EETs对平滑肌KATP通道的作用与蛋白激酶A(PKA)的活性增强有关。Kir6.2为弱Kir,其内向整流机制不明。在Kir6.2的氨基酸序列中缺乏象在Kir2.1内向整流机制中起关键性作用的带负电荷氨基酸:D172、E224。因此,即使增加带正电荷的Mg2+和多聚胺浓度也无法影响通道的内向整流作用。前文提到,不同的Kir通道内向整流机制可能不同。M2和C-末端带负电荷氨基酸的多少与通道内向整流程度无关。但什么是Kir6.2内向整流分子学基础?笔者发现Kir6.2通道蛋白的氧化还原状态影响其整流性质。在通道的胞浆侧给予H2O2后,Kir6.2的整流性质发生戏剧性变化,即从内向整流转变成外向整流(图4A)。给予特异性巯基还原剂(DTT)可恢复Kir6.2的内向整流特性。进一步研究证实,第166位半胱氨酸(C166)是Kir6.2的功能性氧化还原靶点。将该半胱氨酸变成丙氨酸(C166A),H2O2的作用消失(图4B)。C166氧化如何改变通道的整流性质还不明确。可能是C166位于Kir6.2通道M2的末端,其巯基氧化导致通道门控环三级结构的变化,从而引起通道内向整流性质的改变。具体机制仍在进一步研究中。2.2全细胞katp电流KATP电流记录方法与IK1相同。成功记录与否和ATP浓度有很大关系。正常心肌细胞ATP浓度在1~2mmol/L左右。而ATP对KATP通道半效抑制浓度为30μmol/L。因此,大多数KATP电流记录实验都在膜内面向外模式上进行,只有这样才能准确地控制实验中的ATP浓度。在全细胞记录上较难做到准确地控制细胞内ATP浓度。特别在心肌细胞新鲜分离时,细胞非常健康,胞内ATP含量高,很难记录到全细胞KATP电流。这时,往往要给予钾通道激活剂(如Pinacidil)进行干预或有目的地选择非健康细胞进行实验。因心肌细胞膜上具多种K+通道,有目的地将维持电压设制在0mV水平,使细胞膜上电压门控型K+通道失活。心肌细胞含有多种Kir通道。为去除其他Kir电流对KATP电流的“污染”,通常在总Kir电流的基础上给予特异性KATP通道抑制剂(如HMR-1098,glyburide等)。将KATP电流充分抑制后,残余部分为其他Kir电流成份。从总Kir电流中减掉这些KATP通道抑制剂不敏感的残余部分,可得到纯粹全细胞KATP电流。心肌细胞单通道KATP电流呈特征性簇状开放Kir(burstopenings),即通道的开放与关闭呈快速转换,并间隔以较长时间的通道静息状态(长关闭状态),形如簇状。因篇幅有限,有关KATP电流单通道分析方法请参阅具体文献。图5显示大鼠心室肌细胞KATP通道电流的单通道及全细胞记录。3g蛋白藕联受体基因编码:KCNJ3/KCNJ5。又称G-蛋白门控型Kir(Gprotein-gatedinwardlyrectifyingK+channel,GIRK)或蕈毒碱能钾通道(muscarinicK+channel)。KAch通道主要分布在心房肌、窦房结和房室结,参与迷走神经对心脏功能的调节。激活心房肌KAch通道使动作电位时程缩短、膜电位超极化。激活窦房结和房室结KAch通道使心率和窦房传导减慢。KAch通道是典型的通道-受体-酶组成的蛋白复合体,由两部分组成:孔道构成蛋白Kir3亚基和G蛋白藕联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCR)。Kir3亚基结构和其他Kir2.1亚基基本一样。4个Kir3.1和(或)Kir3.4亚基构成离子通透孔道。G-蛋白藕联受体含7个跨膜区段,具有G蛋白酶的功能。一般情况下G蛋白以无活性(Gα-GDP-Gβγ)的形式与受体组成蛋白复合体。当乙酰胆碱与受体结合后,蛋白复合体构象改变,有利于GTP置换GDP。GDP被GTP置换后,使Gα-GTP和Gβγ分离,并从细胞膜受体上脱落下来。Gα-GTP和Gβγ是重要的细胞内第二信使。目前发现:Gβγ能与Kir3.1亚基C-末端的亮氨酸(I262和I333)结合,增强Kir3.1通道的活性。另外,细胞内Na+与Kir3.4亚基的C-末端的天冬氨酸或天门冬氨酸结合,激活Kir3.4通道。在心房肌,50%的KAch通道是Kir3.1和Kir3.4亚型组成的杂合体;其他50%完全由Kir3.4亚型组成的纯合体。目前公认Kir3.1/Kir3.4亚型杂合体是心脏功能性KAch通道的表现型,有如下特点:①有较强的内向整流作用;②对乙酰胆碱和Gβγ敏感;③对细胞内Na+不敏感。反之,Kir3.4亚型纯合体为非典型KAch通道,其内向整流作用较弱,对乙酰胆碱不敏感,但对细胞内Na+非常敏感。在无激活剂的情况下,基础开放水平高。这些不同的电生理学差异对心房颤动(简称房颤)的发生发展有重要意义(见后述)。KAch通道属强Kir,其单通道电导介于Kir2.1和Kir6.2之间,约为60pS。在乙酰胆碱诱导下,KAch电流的记录方法与其他Kir通道相同。这里不再重复。在鉴别上除了电导不同外,胆碱能受体阻滞剂可有效地阻断乙酰胆碱对KAch的激活作用。4kir通道功能异常与心脏疾病Kir通道活性直接影响心脏的泵功能及心电稳定。已发现与心脏有关的Kir通道病如下。4.1其他普通性基因又称Anderson-Tawil综合征。为显性遗传性疾病。临床表现:心律失常、周期性麻痹、畸型面容(小下颚,宽眼距,低耳,牙齿畸型等)、畸型骨骼和指趾关节活动异常等。心电图表现:QRS波增宽、Q-T间期延长、频发室性早搏及自发性室性心动过速。Anderson-Tawil综合征又可再分为两型。第1型为KCNJ2基因异常,占发病率的60%。自从2001年Plaster等首先发现在这些患者中存在KCNJ2基因变异以来,共发现KCNJ2基因位点变异30余处。这些变异位点散在,并直接导致IRK1通道功能或内向整流特性的丧失,使动作电位时程延长、易诱发延迟后除极。第2型原因不明,占总发病人数的40%。4.2天冬氨酸变异为天冬酰胺Priori等报道遗传性短QT综合征是由于KCNJ2基因变异。变异位点在第172氨基酸,由天冬氨酸变异为天冬酰胺(D172N)。前文提到D172是通道内向整流的重要分子结构。该位点突变导致IRK1通道内向整流作用减弱、K+外流增加,引起3相动作电位时程和心电图QT间期缩短。4.3不同结构的sart-pcr反应Bienengraeber等报道在323例特发性扩张型心肌病患者的基因中,2例存在ABCC9基因38外显子发生杂合子变异。DNA测序发现患者甲的SUR2A在第1524位氨基酸处发生框架位移(frameshift,Fs1524)。患者乙在第1513位氨基酸处发生无功能突变(A1513T)。第1513位和第1524位氨基酸位于SUR2A中近NBF2的ATP结合位点处。这些氨基酸突变使NBF2的ATP酶的活性减低,ATP水解能力下降,故ATP对KATP通道的抑制作用增强。导致心肌对能量需求的感知不良及能量利用障碍。产生心肌器质性病变。4.4房后壁土壤分析房颤已成为最常见的心律失常,占心律失常临床治疗病人的1/3以上。房颤的发病机制长期存在“触发”与“折返”之争。目前流行的“转盘”(rotor)假说综合以上两种机制,即需要一适时的期前刺激诱发心肌不应期的延迟,并产生两个反向运行的折返环,其中频率较快的折返环得以维持。肺静脉与左房后壁交界处对房颤的发生、维持至关重要。电生理研究显示:此处移行区电传导缓慢,并存在起搏细胞。离子学研究发现在某些病理条件下,肺静脉交界处的心房肌L型Ca2+通道、RyR和Ca2+释放通道活性增强,导致细胞内游离Ca2+浓度增高、短暂内向电流增加(主要是Na+-Ca2+交换电流)。另外,肺静脉交界处的心房肌IK1较弱、短暂外向电流(transientoutwardcurrent,Ito)、超快速外向电流(ultrarapidoutwardcurrent,IKur)和延迟整留性钾电流(delayedrectifierK+currents,包括IKr和IKs)较强,导致动作电位0向上升速率小、静息电位负值较小、动作电位时程较短。综上所述,这些组织学和离子学特性的改变容易引起肺静脉与左房后壁交界处自律性增加、触发活动和折返环的形成。目前认为,在原发性和继发性房颤患者中,心房组织Kir通道家族功能异常也起重要作用。4.4.1房颤病人mrna水平和kac