反复冻融法破壁啤酒酵母的探索

反复冻融法破壁啤酒酵母的探索

啤酒废水是生产啤酒的副产品。我国是一个啤酒生产和消费大国,年产啤酒超过3500多万吨,产生啤酒废酵母约30万吨。对啤酒废酵母进行综合利用研究,将产生巨大的经济效益和社会效益[1~2]。啤酒酵母的细胞壁结构厚实,致密,给啤酒酵母内容物提供了良好的保护作用,给啤酒酵母的利用增加了难度[3~5]。破壁是为了破碎细胞的外壳,使细胞内含物释放出来。目前,所研究的酵母细胞破壁方法主要分为物理破壁、化学破壁和生物破壁3种[6~8]。反复冻融法是利用冻结-解冻过程中在酵母内部的冰晶体对细胞壁的机械作用而使其破裂的一种物理方法。目前,这种方法在果蔬榨汁工艺被研究使用,例如,反复冻溶法用在葛仙米(一种多细胞丝状微藻)的破壁过程中,可以获得良好的破壁效果;用在葡萄的榨汁过程中,葡萄出汁率得到明显提升,且葡糖汁的糖度较高;经过冻融法处理,大米蛋白质的溶出率会得到较大程度的提高。反复冻融法是属于比较温和的破壁方式,可以避免高温对原料所造成的营养损失、风味劣变等不良影响。啤酒酵母中含有SOD等热敏性成分,选择低温破壁的方式有助于这些成分的保存,目前尚没有利用反复冻融法破壁啤酒酵母的研究报道。1材料和方法1.1试验材料啤酒酵母粉:珠江啤酒厂副产物。主要仪器:冰箱,水浴锅,凯氏定氮仪,分光光度计,光学显微镜,离心机等。1.2测试方法1.2.1试验程序1.2.2试验设计1.2.2.反复冻融法设计5个处理,分别为喷加5%、10%、15%、20%和25%的蒸馏水,反复冻融3次,每次冻结时间为2h,解冻时间为30min,每个处理设置2个重复。1.2.2.冻融时间的确定处理为喷加20%的蒸馏水,分别做0次、2次、3次、4次和5次冻融,每次冻结时间为2h,解冻时间为30min,每个处理设置2个重复。1.2.3测量1.2.3.整酵母数的测定采用直接计数法:通过检测破壁工艺前后物料中存在的完整酵母数的比值,公式如下:式中:A———破壁工艺前完整酵母数;B———破壁工艺后剩余的完整酵母数。完整酵母数的测定:采用直接计数法(25格中方格计数板),将沉淀分离啤酒酵母蛋白后的滤渣定量稀释至400倍(即1g原料溶解至400mL),经分散均质,点样至血球细胞计数板,利用光学显微镜在400倍下观察,对完整酵母进行直接计数。每个样品随机选取5个中方格计数,并做2次重复,记录完整酵母数,按照以下公式计算得到样品中完整酵母总数。1mL菌液中的细菌数=C/5×25×10×1000×D(个)式中:C———5个中方格中的总完整酵母数;D———稀释倍数。1.2.3.紫外分光光度法检测总光度采用微量双缩脲法:在试管中分别加0mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL、1.60mL、1.80mL蛋白质标准溶液,用水补足到3.00mL,加3.00mL6%的氢氧化钠溶液混匀,再加0.30mL微量双缩脲试剂,混匀后在室温(25℃)保温15min,在310nm处用紫外可见分光光度计测定吸光度值,回归方程为y=1.0983x-0.0242,R2=0.9652,回归曲线见图1。定量吸取3.00mL经稀释一定倍数的上清液,按照以上步骤,测定其吸光度值,由回归方程得出其中可溶性蛋白的含量。2结果与分析2.1反复冻融法破碎细胞的观察反复冻融法处理啤酒酵母前后,通过400倍光学显微镜观察其状态,见图2、图3。经过对比发现,在显微镜下原啤酒酵母细胞明显,细胞壁残片类成分较少,经过反复冻融3次以后,具有完整细胞结构的酵母较多,但其在同样的显微镜条件下,可以观察到酵母细胞外壁光滑度有所降低,并且含有一定量的细胞壁残片成分,可以初步判断反复冻融法对于酵母细胞的破壁作用是有效的。2.2反复冻融法破壁率随加水量的变化表现出破壁率的变化由受细胞内外的水分是形成冰晶体的物质基础,与冰晶体量的大小有直接的关系。从图4可以看出,破壁率曲线与可溶性蛋白曲线均呈先快速上升、后趋于平缓的趋势。二者的区别在于破壁率随加水量上升的趋势小于可溶性蛋白上升趋势,这可能是由于反复冻融法破壁作用温和,在显微镜计数时,某些破壁程度较小的细胞无法被识别,不能体现出破壁率,而这种破坏程度却足以使其内部的一部分可溶蛋白溶出。加水量对反复冻融法破碎酵母细胞壁的效果有较大影响,在加水量为20%时可溶性蛋白达到19.53g/100g,破壁率达到35.1%,加水量大于20%时,破壁率及可溶性蛋白均变化不大,说明细胞内部间隙在加水量20%左右时被水分完全填充,致使在冻结-解冻过程中冰晶体对细胞的机械作用发挥到最大。2.3反复冻融3次本试验加水量因素设置为20%,结果如图5。从图5可以看出,破壁率与可溶性蛋白溶出均随冻融次数的增加而逐渐增加,反复冻融2次的可溶性蛋白比未冻融处理高出约20.66%,反复冻融3次比未冻融高出约48.31%;在反复冻融低于2次时,破壁率增加不明显,这可能是由于细胞壁被破坏程度较小,不容易观察所致。冻融次数大于3次以后,由于冰晶体的反复作用,使得细胞破裂程度容易观察,破壁率依然呈明显的上升趋势,在冻融达到5次时破壁率达到48.6%,而可溶性蛋白曲线却趋于平缓,证明了尽管细胞壁破裂程度无法用显微镜观察,其可溶性蛋白依然可以溶出,显微镜下观察到的破壁细胞,其可溶蛋白早已溶出。3可溶性蛋白含量3.1反复冻融法破壁的最佳参数为:加水量20%,反复冻融次数3次。在此参数下,破壁率达到35%,可溶性蛋白达到20.9g/100