离子交联法制备壳聚糖微球的研究

离子交联法制备壳聚糖微球的研究

地壳聚糖是自然界中的第二糖，通过脱乙酰基反应得到。甲壳素是虾、螃蟹的主要成分，也是真菌壁的主要成分。壳聚糖的结构与纤维素相似但是与纤维素不同的是在其糖苷链上连接着2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖,正是因为壳聚糖有了这个氨基使其广泛的应用于药物制备与研发当中。离子交联的原理是聚阴离子交联剂与壳聚糖链上的NH+3通过静电吸附连接在一起。这种方法制备的壳聚糖微球能避免了大部分化学交联剂如二醛类交联剂对人身体的危害。常见的离子交联剂主要有三聚磷酸钠,六偏磷酸钠,葡聚糖硫酸酯,柠檬酸盐和硫酸盐等。但是用焦磷酸钠作为离子交联剂在国内外鲜有报道。本文以焦磷酸钠作为离子交联剂,以载药量和包封率为指标,转速、交联剂滴加时间、载药量为影响因素,对微球的制备工艺进行了考察。1实验部分1.1试剂:实验试剂见表1壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司,脱乙酰度为80.0%～95.0%,生化试剂);水杨酸(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);异丙醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);焦磷酸钠(分析纯,天津市博迪化工有限公司),其他试剂均为分析纯。恒温电磁搅拌器(DF-101S,巩义市英峪予华仪器厂);激光粒度分布仪(BT-9300H,丹东市百特仪器有限公司);扫描电镜(SEM,JSM-6360LV,日本电子公司);紫外分光光度计(Hitachi310,日本日立公司);pH计(S20P,瑞士梅特勒-托利多公司);红外光谱仪(NEXUS470,美国热电公司)等。1.2实验过程1.2.1壳聚糖悬浊液的制备先称取0.5g的壳聚糖并溶于50mL(2%V/V)醋酸溶液中,制得1%(W/V)的壳聚糖醋酸溶液,然后用循环水式真空泵抽滤除去壳聚糖中的杂质。在室温下,向壳聚糖醋酸溶液中滴加NaOH溶液(0.1mol/L),调节pH值在一定范围。加入一定量的布洛芬,搅拌30min使其成为均一、稳定的悬浊液。在一定滴加时间、转速的条件下,将一定量焦磷酸钠溶液(0.7g/L)滴加到上述悬浊液中,得到壳聚糖微球溶液。停止反应后,加入NaOH溶液,产生絮状沉淀,将产物分放在50mL离心管内,用台式低速自动离心机(3000r/min)离心4min,弃去上层清液。用蒸馏水洗涤离心产物3次,最后将产物在-43℃的条件下冻干24h,即得到壳聚糖载药微球。1.2.2壳聚糖的功能壳聚糖是由N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖组成的共聚物,并且其含有mmol的乙酰氨基葡萄糖和nmol氨基葡萄糖。当m≫n时表明该物质是甲壳素而当m≪n时该物质为壳聚糖。壳聚糖脱乙酰度(fD)的公式:fD=nm+n(1)fD=nm+n(1)每个壳聚糖单元的相对平均分子质量由下式可得:MCS,mon=Mwm×(1−fD)+Mwn×fD(2)ΜCS,mon=Μwm×(1-fD)+Μwn×fD(2)式中Mwm为191g/mol而Mwn为161g/mol。壳聚糖的摩尔氨基含量(C¯¯¯C¯NH2,molNH2/g壳聚糖)C¯¯¯NH2=fDMCS,mon=fDMWm×(1−fD)+MWn×fD(3)C¯ΝΗ2=fDΜCS,mon=fDΜWm×(1-fD)+ΜWn×fD(3)所以通过上式可以算出脱乙酰度为90%的壳聚糖的摩尔氨基含量为5.49×10-3mol/g。焦磷酸钠为聚阴离子交联剂。所以焦磷酸钠的摩尔阴离子含量可由下式得出:C¯¯¯anion=1Mwanion×n(4)C¯anion=1Μwanion×n(4)式中Mwanion为聚阴离子交联剂的相对分子质量,n为一个分子中能提供阴离子的量。焦磷酸钠的相对分子质量是266,一个焦磷酸钠分子(Na4P2O7)能提供4个阴离子。所以焦磷酸钠的阴离子含量为9.402×10-4mol/g。而常用的交联剂三聚磷酸钠的阴离子含量为5.437×10-4mol/g,六偏磷酸钠的为2.724×10-4mol/g都多。所以使用焦磷酸钠作为交联剂可以节省一定的生产成本。1.2.3布洛芬载药量的测定精确称取0.1g载药微球置于20mL的乙醇中,超声使微球中的布洛芬完全溶于乙醇中,过滤,取滤液,测其吸光度,确定溶液中布洛芬的浓度,计算其载药量及包封率:载药量=微球中所含药物量/微球总量×100%(5)包封率=微球中包封的药量/投入的总药量×100%(6)2结果与讨论2.1微球的结构性能2.1.1吸收峰的确定通过比较壳聚糖与焦磷酸钠交联壳聚糖微球的红外光谱,可以清楚的看到3425cm-1处是壳聚糖上氨基和羟基的吸收峰,与(a)相比较(b)在3425cm-1处变窄这是因为一部分氨基被质子化之后与阴离子静电吸附的结果。(图1b)1100cm-1处和1079cm-1处的吸收峰是焦磷酸钠-P=O官能团,这表明交联微球中含有焦磷酸钠。1632cm-1取代了1660cm-1处的吸收峰是因为焦磷酸钠上的阴离子与壳聚糖上的-NH+3相互作用的结果,也说明了两者的反应机理为静电吸附。布洛芬的红外光谱显示在2955cm-1处是-OH键的伸缩振动峰,而在1719cm-1处是羰基的伸缩振动峰,在1500cm-1与700cm-1之间的峰是由于药物中含有芳香环的缘故。在1420cm-1处的特征峰是碳碳双键,779cm-1是苯环中的C-H键弯曲振动峰,1325cm-1是-CH3的弯曲振动峰。在载药微球中3425、1577、1079cm-1这些特征峰都来自于空白微球,而2955、1420cm-1的特征峰则来自于布洛芬。而布洛芬在1719cm-1处的特征峰消失,这证明布洛芬中的羧基与壳聚糖中的自由氨基相互作用。2.1.2抗氧化性分布从图2a中可以看出交联微球的呈球形较好,粒径在7～8μm,表面较粗糙,有层状结构。通过图2b可以看到微球表面凹凸不平,层状结构明显,有少许小孔,有利于药物的负载和释放。在图2c上可以清晰的看到微球内少许的布洛芬药物,图2d显示的是载药微球内部形貌,可以清楚的看到微球内部载有大量的布洛芬药物晶体。2.2单因素评价了壳聚糖微球的制备过程2.2.1ph值对载药微球粒径的影响固定交联剂的滴加时间(30min)、投药量(0.1g)、转速(325r/min)、正负电荷摩尔比(30∶1),改变壳聚糖溶液的pH值对载药量和包封率的影响。初始的壳聚糖溶液的pH值为3.68,用1～0.1mol/L的NaOH溶液调节壳聚糖溶液的pH值。使壳聚糖溶液pH值为4.00～6.00(±0.01)。载药量和包封率如图3所示。当pH值在3.68～4.50的时候,当pH值继续增大时,形成的微球内的-NH+3由于受pH值的影响,正电荷数减少,微球内相同电荷排斥作用减小,微球收缩,粒径减小,所载药物的质量也随即减少。此时主要以包埋的再要方式为主,微球粒径越大,载药与包封率越大。当溶液pH值为4.50时(布洛芬的pKa值为4.55),布洛芬的分子形式和离子形式各占50%,此时布洛芬药物的离子形式带负电荷,与带正电荷的壳聚糖发生静电吸附作用。随着溶液pH值的增大,药物的离子形式也随之增大,此时离子间的相互作用起主导作用。实验结果表明适宜的pH值为3.68。2.2.2壳聚糖与焦磷酸钠摩尔量比对微球载药量和包封率的影响固定交联剂的滴加时间(30min)、投药量(0.1g)、转速(325r/min)、pH值(3.68),改变交联剂的用量来考察正负电荷摩尔比对微球载药量和包封率的影响。根据公式(3)计算:0.5g的壳聚糖能够产生2.745×10-3mol的NH+3通过计算使NH+3的摩尔量与焦磷酸钠所产生的负电荷的摩尔量之比即正负电荷摩尔比为5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。当摩尔比为5∶1和10∶1时,由于交联度过大产生白色絮状沉淀。而在摩尔量之比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1对微球载药量和包封率的影响如图4所示。随着摩尔比的增加即交联剂的减少,微球的载药量和包封率均减少。这是因为交联剂的减少所得的微球网孔变大不利于药物的载入。适宜的摩尔比为20∶1。2.2.3交联时间的影响固定正负电荷摩尔比(20∶1)、投药量(0.1g)、转速(325r/min)、pH值(3.68),改变交联时间来考察其对微球载药量和包封率的影响。将交联剂的滴加时间分别定在10、20、30、40、50、60min。在时间为10min时由于交联时间短,微球还没完全形成。而在20～60min之间滴加时间对微球的载药量和包封率的影响不大(如图5所示)。综合操作的难易和实间,适宜的滴加时间为30min。2.2.4布洛芬的量对微球载药量和包封率的影响固定正负电荷摩尔比(20∶1)、交联剂的滴加时间(30min)、转速(325r/min)、pH值(3.68),改变布洛芬的量来考察其对微球载药量和包封率的影响,依次0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g。由图5可知投药量的增加载药量增加幅度不大,但是包封率急剧减少。综合考虑,本工艺需投入0.5g壳聚糖,其载入0.05g的布洛芬原料药更为经济,包封效果更好。2.2.5转速对载药量和包封率的影响固定正负电荷摩尔比(20∶1)、投药量(0.05g)、交联剂的滴加时间(30min)、pH值(3.68),改变转速来考察其对微球载药量和包封率的影响。使转速为325、542、759、975、1192、1300、1408r/min。从转速对载药量和包封率的影响(如图6)上看,在325～759r/min之区间内载药量和包封率均随转速的增加和降低,这是因为壳聚糖的机械强度在高