土壤与环境微生物研究法

PAGEPAGE91第七章土壤微生物区系分析 92第一节一般土壤微生物的分离与计数 92一、稀释平板法 92二、MPN稀释法 94三、土粒法 96第二节厌氧微生物的分离 96一、充氮厌氧培养法 96二、焦性没食子酸吸氧法 97三、专性厌氧细菌的分离法 98第三节土壤主要类群微生物的分离与计数 99一、好氧细菌的分离与计数 99二、丝状真菌的分离与计数 100三、放线菌的分离与计数 100第四节土壤中功能微生物的测定 101一、氨化细菌的测定 101二、硝化细菌的测定 102三、反硝化细菌的测定 104四、好氧性自生固氮细菌的测定 105十一、纤维分解菌的测定 106十二、光合细菌的测定 108十三、甲烷产生菌的测定 109十四、有机污染物降解菌的测定 110十五、重金属抗性菌的测定 111第八章根圈微生物分析 111第一节根圈细菌的分析 112一、根圈的分区 112二、根圈细菌的分离 112三、根圈优势菌株的分群 114第二节植物组织内微生物的分离 115一、植物材料的选择 116二、组织表面消毒 116三、分离方法 117第十五章土壤微生物生物量的测定 119第一节土壤样品采集与预处理 119第二节土壤微生物生物量碳分析 120一、熏蒸提取——容量分析法 120第三节土壤微生物生物量氮分析 124一、熏蒸提取——全氮测定法 125二、熏蒸提取——茚三酮比色法 127第四节土壤微生物生物量磷分析 129一、熏蒸提取——全磷测定法 129第十七章土壤生物化学过程强度测定 130第一节土壤呼吸作用 130一、密闭静置培养测CO2法 130二、通气培养测002法 131三、田间收集C02法 132第二节土壤氨化作用 133一、土壤培养法 133二、氨化菌培养液培养法 134第三节土壤硝化作用 135一、土壤培养法 136二、培养基接种土壤悬液法 137三、纯菌培养法 138四、环流法 139第四节土壤反硝化作用 140一、硝酸盐消失法 140二、气相色谱法 142第五节土壤固氮作用 145一、土壤培养测全氮法 145二、无氮培养液培养法 146三、乙炔还原法 147第六节土壤磷素的转化作用 151第十八章土壤酶活性测定 152第一节氧化还原酶 153一、脱氢酶 153二、多酚氧化酶 154三、过氧化氢酶 155四、过氧化物酶 156五、硝酸还原酶 158六、亚硝酸还原酶 159七、硫酸盐还原酶 160第二节水解酶 161一、脲酶 161二、蛋白酶 163三、α-淀粉酶和β-淀粉酶 164四、脂肪酸 165五、转化酶（蔗糖酶） 166第七章土壤微生物区系分析土壤是微生物生活的大本营，也是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤微生物区系（soilmicroflora）是指特定土壤生态系统中生活的微生物的数量和组成状况，是反映土壤微生物生态特征的重要指标。由于在不同的地理地带、不同的土壤类型、不同的季节和不同的土壤条件以及农业措施等影响下，微生物的数量组成是不同的，因此，对了解不同土壤生态系统中微生物区系的动态变化及挖掘所需的土壤微生物资源，与对了解土壤基本理化性质一样，仍具有重要的现实意义。第一节一般土壤微生物的分离与计数从自然界或混有杂菌的培养体系中将所需要的微生物在培养基上形成单个菌落，称为菌种分离。分离土壤微生物的方法很多，但是所有的方法都有一定的局限性，因此也各有利弊．常用的有稀释平板法、MPN(mostProbablenumber)稀释法和土粒法。一、稀释平板法稀释平板法是测定土壤中活的微生物数量最常用的一种方法。该方法操作简便，而且可以同时从土壤中分离获取较多种类的微生物，井进行计数。（一）基本原理本方法是基于这样的假设，即当已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物与土粒分开，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开来，以便于计数和移植。（二）操作步骤1)用1／100感量的天秤称取10g土样加入盛有100mL无菌水的500mL三角瓶中。同时称取待测土样10~llg(记下准确质量)，经105'(2烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，按下式计算土壤含水量的百分数。土壤含水量(％)=（湿土重—干土重）/湿土重*1002)将盛有10g土样和10010min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。3)土壤分散后，吸取1mL土壤悬液到9mL稀释液中(或吸5mL到45mL稀释液中)，依次按10倍法稀释，通常稀释到10-6。所用的吸管在每次吸取悬液时，在稀释中反复吸人吹出悬液3~5次，以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。4)根据各类微生物在土壤中的数量多少选择经过适当稀释的悬液接种。一般真菌采用的稀释度为10-3一10-1，放线菌为10-5～10-3，细菌为10-610-4，每一稀释度必须重复3~5次，重复越多，越准确。’5)土壤悬液接种刮刀法先于灭菌培养皿中倾注18mL左右选择性培养基，凝固后，用1mL无菌吸管于瑚9表面加0.05mL(相当于1／20ml)或用无菌移液枪吸50μL一定稀释度的土壤悬液，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹于琼脂表面。混菌法吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷至45℃凝固后倒置保温培养。6)接种了土壤悬液的培养皿，待培养基凝固后倒置于28～30'C恒温箱中培养一定时间(细菌2~3天，真菌3～5天，放线茵5~7天)后取出，细菌和放线苗选取出现菌落数在20~200的培养皿，真菌选菌落数在10～100的培养皿，被扩散性细菌或真菌菌落占据琼脂表面15％的培养皿应该剔除，因为它们抑制了其他菌落的正常发育，从而造成试验误差。7)结果计算用刮刀法接种的计算方法：用混菌法接种的计算方法：通常以cfu(colonyformingunit)／g千土表示。(三)注意事项1)用同一支吸管接种同一样本不同稀释度的悬液于培养皿时，应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。2)分离细菌时，为了避免由于某些细菌菌落扩散造成误差，倒皿时培养基温度不宜太高或待倒人的培养基凝固后，将培养皿微启，倒置于60~70℃烘箱中1后，用同法涂抹土壤悬液。3)分离芽孢杆菌时，应事先将样品中无芽孢细菌杀死。所以要预先选取适当稀释度的土壤悬液于75~80'C水浴中煮15rain，然后再按上述方法涂抹于琼脂表面。4)稀释平板法可因下列原因造成误差，因而对土壤中实际存在的微生物数量可能估计过低：①土壤悬液中有的菌成群聚集在一起或附在土粒上未被分散，因此在乎板上形成的菌落数比实际菌数低；②稀释液可能杀死某些微生物，③有的孢子在这种条件下不Q9发芽，因而不能发育成肉眼可见的菌落；④有的细胞在操作过程中被吸附在管壁上；⑤培养基和培养条件有较高的选择性，以致相当一部分微生物不能正常发育形成苗落，5)稀释平板法并不是对所有的微生物类群都同样适用，一般来说这个方法最适用于苗体大小和重量都差不多的类群，如细菌和酵母。放线苗和真菌因菌体的不同部分的大小和质量相差较大，如菌丝、孢子和其他孢子器等质量大小均有较大差异。严格来说，用此法所得菌落多数从孢子发育而来，而且与菌丝发育而成的菌落不能区分。6)用此法时干扰结果的因素较多，因此各个实验室对操作程序的每一细节都应有自己的规定，以便于结果之间的相互比较。二、MPN稀释法对具特殊生理功能的细菌，常采用稀释法计数，又称最大或然数法。如硝化菌、反硝化菌、厌氧固氮菌、硫化苗、反硫化菌、纤维素分解菌等。(一)基本原理本方法是基于选择适当稀释倍数的土壤悬液，接种在特定的液体培养基中培养，再检查培养液中是否有该生理类群微生物的生长。根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出每克土壤中某生理类群的微生物数量。(二)操作步骤1)土壤悬液制备方法同稀释平板法1)一3)。2)根据微生物各类群在土壤中的大概数量选择5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中。每管接悬液1mL，每一稀释度重复5管(3—5管均可，重复越多，结果越准确)，即一个样品每种培养基25管。3）于28℃4）根据各稀释系列试管中有无待测微生物生长或其生理反映的正负得出数量指标，并根据重复数量不同而在相应的稀释法测数统计表中查出细菌近似值。应用稀释计数法计数时，菌液稀释度要合适，要求在稀释系列中最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而必须最后一个最高稀释度所有重复都没有微生物生长。确定数量指标系取稀释系列中所有重复都有生长(或呈正反应)的最高稀释度为数量指标的第一位数字。例如，稀释度10-110-210-210-4，10-5生长情况++++++++++++++-++--------重复数55420数量指标为542，由表查得近似值为25。如果在所有重复试管内都有微生物生长的稀释度之后仍有三个数字，则将最后二个数字加到前一个数字上。例如，稀释度10-110-210-310-410-5生长情况+++++++++-++---++--------重复数5则数量指标为542+2=5445)结果计算每克干土中菌数＝设样品含水量为20％，则干土为80％每克干土中菌数＝25*102*100/80三、土粒法对于在土壤中数量较少的某些微生物，有人采用将土粒直接按种在选择性培养基上的方法来分离计数。如好氧性自生固氮菌、纤维素分解苗及其他种类的微生物等。(一)基本原理本法是把供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的南落围绕着颗粒发育起来。由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。(二)操作步骤1)取少量土样加无菌水调成糊状。2)用粗细适当的圆头玻璃棒沾糊状土样，点在已凝固的选择性琼脂平板上。3)于28℃即第二节厌氧微生物的分离厌氧微生物与好氧微生物的根本差别在于二者的呼吸机制不同。好氧微生物将氧作为生物氧化作用的最终受氢体，只有在有氧条件下才能生活。而厌氧微生物则只能在无氧条件下进行无氧呼吸，以葡萄糖的氧化物作为受氢体，有氧时反而对其有毒害作用。因此，在分离和培养厌氧微生物时必须为其提供这两个条件。厌氧细菌的常用培养基见第四章第三节。这里介绍几种厌氧培养方法。‘一、充氮厌氧培养法(一)培养原理用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用氮气、二氧化碳或氢气代替真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可得表面茵落。(二)操作步骤1)将接种了不同稀释度土壤悬液的琼脂平板或试管置真空干燥器中，同时在干燥器中放人盛有美蓝氧化还原指示剂的试管(或小三角瓶)，以检验干燥器内是否确为无氧状态，若美蓝指示剂为无色则表示已经无氧，如果指示剂呈盘色则表示仍有氧存在。2)在干燥器口加封闭油膏，盖紧，进行抽气和换气。将盛氮气或氢气的钢瓶与真空干燥器及气体抽换装置连接(图7-1)。3)先将真空干燥器出口活塞2打开，关闭活塞3，打开活塞1，使真空干燥器、压力表、气候干燥塔与真空泵联通，然后进行抽气，使气压下降至0．02~0．05个大气压时，先关闭活塞1，再停止抽气。4)小心转动活塞3或钢瓶减压阀，使氢气或氮气缓缓流经洗气瓶进入真空干燥器(注意放气勿过猛)，充气到0..8~0.9个大气压，将活塞3或钢瓶减庄阀关闭，开动真空泵抽气，然后打开活塞1。抽气到0．02~0．05个大气压后再行灌气。如此反复2或3次。5)最后一次将真空干燥器内气压加到略小于1个大气压。6)关闭真空干燥器活塞2。取下干燥器并用螺旋皮管夹将其管口夹紧，以免漏气。真空干燥器置3CC恒温室培养10~14天，待培养基表面长出单个菌落后，即可由真空干燥器取出培养皿，计算菌落数或挑菌移置斜面。二、焦性没食子酸吸氧法该方法利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧气，可创造厌氧条件。每克焦性没食子酸在过量碱液中能吸收100mL空气中的氧。其吸氧变化如下：(一)实验试剂美蓝氧化还原指示剂。介绍两种配方，第一种配方：A液：0．006mol/L氢氧化钠(NaOH)。B液：0.015％美蓝溶液。C液：6％葡萄糖溶液。以上三种溶液在使用时等量混合，加热使美蓝褪色，迅速放人厌氧培养容器中。第二种配方：A液；0．04％(m／v)美蓝，溶于0..2mol／L磷酸盐溶液(pH7.0)B液：0．5％(m／V)抗坏血酸液1mL。C液：0．6％(m／v)琼脂8mL(琼脂用量还可减少)，只要能够呈凝胶状即可。先加热琼脂溶液，然后加A液和B液于指形管(75mm*lmm)中，总量5mL。有氧时表面为蓝色圈，无氧时五色。不用时塞紧指型管，以免完全氧化。此管可反复使用。若蓝色延伸至1t2以上时，则要在沸水浴中使指示剂还原褪色后再用。(二)操作步骤于真空干燥器(或大试管)中，先加入焦性没食子酸若干克，即根据容器的体积按1s焦性没食子酸能吸收100mL空气中的氧来计算其应加入量，然后按焦性没食子酸与10％NaOH的比为l：l0，加入相应体积的10％NaOH，立即将培养皿(或试管培养物)和加热褪色后的美蓝氧化还原指示剂放人真空干燥器(或大试管)中，盖紧密封，以免漏气(图7—2)。置30℃三、专性厌氧细菌的分离法在分离专性厌氧细菌时，要求将各操作过程尽可能少地接触空气，方法如下：(一)培养基的制备按分离的对象配制培养基，且培养基应除去其中的溶解氧，如图7-3所示，于调配过程不断通人经过高温炉去除了残余氧气的氮气。（二）培养基加入待分离悬浊液的方法配制后的培养基注人待测液时，仍要避免接触空气，如图7—4所示，边通氮气于盛有培养基的圆底烧瓶中，边用滴管(使用前进行干热灭菌，180℃，30min)将培养基移人含有1（三）分离菌株于上述培养过程长出菌落的培养管中，边通入不含氧的氮气边用铂金丝挑菌，挑出的菌体立即接种在斜面培养基上。接种时，被移植的斜面琼脂管亦处在不断通氮气的情况下进行(图7-5)。移接后立即用橡皮塞密封斜面培养基试管，待长出菌苔后备用。第三节土壤主要类群微生物的分离与计数土壤微生物(soilmlcroorgamsm)是指生活在土壤中借用光学显微镜才能看到的徼／J、生物。它包括不同的类群微生物，如细菌、放线菌以及具有完善细胞核结构的真核生物。它们是土壤物质生物转化过程的重要参与者，在土壤形成和发育、土壤肥力演变、养分有效化和有毒物质降解等方面起着重要作用。这里主要指土壤中的细菌、真菌和放线菌，也就是通常所说的土壤三大苗的分离与计数。一、好氧细菌的分离与计数细菌是土壤微生物中数量最多的一个类群。土壤细菌是一类单细胞、无完整细胞核的生物。它占土壤微生物总数的70％～90％，在每克土壤中的细菌的数量可达几亿乃至百亿个。细菌菌体通常很小，直径为0、2~0、5μm，长度约几微米，因而土壤细菌生物量并不高。它们的种类和生理作用也极其复杂。一般情况下所分离得到的大多数细菌是腐生性的，在土壤有机碳氮转化过程中起着巨大作用。测定土壤细菌的数量通常采用平板培养法。(一)培养基采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，又称营养琼脂培养基，一般认为这种培养基上发育的细菌数量最多。其具体配方参见“第四章第三节·一、·(一)”。若分离芽孢杆菌，采用牛肉膏蛋白胨加麦芽汁琼脂培养基[参见第四章第三节·一、·(一)]。在这种培养基上芽孢杆菌的菌落不扩展，而且菌落特征比较典型和稳定，可以将土壤中常见的几种芽孢杆菌直接鉴别到种。当然，这必须要有足够的经验。(二)操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。二、丝状真菌的分离与计数土壤真菌是指生活在土壤中菌体多呈分枝丝状菌丝体，少数菌丝不发达或缺乏菌丝的具真正细胞核的一类微生物，为化能有机营养型。土壤真菌数量约为每克土含2万～l0万个繁殖体，虽数量比土壤细菌少，但由于真菌菌丝体长，真菌苗体远比细菌大。据测定，每克表土中真菌菌丝体长度lo～100m，每公顷表土中真菌苗体质量可达500～5000kg有机质分解过程的主要成员之—。它们能引起纤维素及其类似化合物的分解作用，同时也能分解含氮的蛋白质类化合物而释放出氨气。由于它们具有强盛的酶系统，分解复杂有机物质的能力特别强。因此，在没有开垦的土壤中，它们的数量并不比细菌少。丝状真菌数量的多少可反映土壤肥力及通气状况。测定土壤丝状真菌的数量一般也采用平板培养法。(一)培养基采用马丁氏(Martin)培养基，其具体配方参见“第四章第三节·二、·(一)”。为了抑制大部分细菌及放线菌的生长，1000mL培养基溶液中应加1％盂加拉红(roseBengal)水溶液3.3mL。临用时每l00mL培养基中加1％链霉素液O．3mL(30rog／L)。(二)操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。三、放线菌的分离与计数土壤放线菌是指生活于土壤中呈丝状单细胞、革兰氏阳性的原核微生物。放线菌在土壤中的分布也很广，其数量仅决于细菌，通常是细菌数量的1％～10％，每克土壤中有10万个以上放线菌，占了土壤微生物总数的5％～30％，其生物量与细菌接近。它们也积极参与土壤中不含氮及含氮有机化合物的分解作用。多种放线菌还能产生抗生素物质。因此，放线菌与土壤肥力以及有机质转化和植物病害防治有着更密切的关系，也是研究土壤微生物不可忽视的一部分内容。土壤放线菌数量的测定一般也采用平板培养法。（一）培养基采用改良高氏I号培养基，其具体配方参见“第四章第三节·四、·(一)”。临用时在已熔化的高氏I号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌的生长。每300mL培养基中加3％重铬酸酸钾1mL(100mg／L)。(二)操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。第四节土壤中功能微生物的测定土壤中存在著各种细菌生理群以及降解性微生物，其中主要的有纤维分解细菌、固氮细菌、氮化细菌、硝化细苗和反硝化细菌等。它们在土壤养分元素循环和污染物降解转化中起着重要作用。因此，分离和认识土壤中各种功能微生物对土壤微生物资源利用与开发具有重要意义。一、氨化细菌的测定氮化细苗类群参与土壤中有机态氮转化为氨气的生物学过程，叫做氨化作用(ammonificafion)。由于这类细菌的活动，使植物不能利用的有机含氮化合物转化为可给态氮，为植物及一些自养和异养微生物繁殖与活动创造了良好的营养条件。因此，分析土壤中这类细菌的组成与数量是很必要的。（一）平板培养法1．培养墓采用牛肉膏蛋白胨瑚S培养基，其具体配方参见“第四章第三节2．操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”，其上生长的好氧细菌，均属氨化细菌。1、蛋白胨氨化培养基(表7-1)培养基在普通滤纸上过滤，装入试管(1．8craXl8cra)，每管装121'C下灭菌30min。每个样品需培养基20支试管。表7-1蛋白胨氮化培养基奈氏试剂：溶解2gKI于5mL蒸馏水中。在此溶液中加入Hgl2小粒至溶解饱和为止(32g)，将12．4gKOH溶于约40mL蒸馏水中。将此溶液倒人Hgl溶液中，加水至l00mL，2．操作步骤选取4个稀释度(如10-9～10-6)的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取，4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28'C条件下培养3天、5天后分别进行检查，根据培养基的混浊度、菌膜、沉淀、气味、颜色等变化来判断氨化细菌的有无(与对照管比较)。第七天用奈氏试剂定性测试有无氨的产生。从培养试管中吸取1或2滴培养液于白瓷板孔中，如加入1或2滴奈氏试剂后出现棕红的或浅褐色沉淀，即表示培养基内有氨的产生。从测定记录结果，按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和茵的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。二、硝化细菌的测定土壤中的硝酸盐类的积累，主要是由氨化作用所产生的氨，通过硝化细菌的活动(硝化作用)氧化为硝酸，再与土壤中的金属离子作用形成硝酸盐。因此，土壤中硝化细菌的存在与活动，对于土壤肥力以及植物营养有着重要的意义。氨氧化为硝酸，是由两类细菌经过两个阶段完成的。第一阶段是氨氧化为亚硝酸，由亚硝酸细菌(氨氧化细菌)来完成；第二阶段是由亚硝酸氧化为硝酸，由硝酸细菌(亚硝酸氧化细菌)完成，两者统称为硝化细菌。土壤中硝化细菌数量的测定，一般情况下只测定亚硝酸细菌的数量。因为土壤中，硝化作用的第一阶段和第二阶段是连续进行的。土壤中很少发现亚硝酸盐的积累。测定参与第一阶段的亚硝酸细菌的数量，即能说明硝化细菌数量的多少。(一)亚硝酸细菌数量的测定1．培养基采用改良的斯蒂芬森培养基，其具体配方参见第四章将培养基在普通滤纸上过滤，装入试管(1．8cm*l8cm5mL，121℃下灭菌30m2．实验试剂格利斯试剂是由两种溶液组成：A液：将0.5B液：将1gα萘胺加到20mL蒸馏水和150mL20％的稀乙酸溶液中。3．操作步骤选取6个稀释度(如10-7~10-2)的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28'C条件下培养14天后，吸取培养液5滴于自瓷板孔中，加入1或2滴格利斯试剂，如有亚硝酸(NO2—)存在，则呈红色，表示有亚硝酸细菌存在。记录测试结果。按附录中《稀释法四次重复测数统计·表》得出数量指标和菌的近似值，参见本章第—节“MPN稀释法”计算结果。如需对亚硝酸细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的亚硝酸细菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的该细菌培养液2mL，加人到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40'C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经富集培养的样品进行悬液接种培养。14天后可观察菌落的生长情况，然后制成涂片，经简单染色，在油镜下可见椭圆形或近于球形的菌体形态。（二）硝酸细菌数量的测定1．培养基采用硝酸细菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节·五·(八)”。将培养基在普通滤纸上过滤，装入试管(1．8em*l8em)，每管装5mL，121℃下灭菌30mi2．实验试剂格利斯试剂：同前。二苯胺试剂：将0．5S五色二苯胺(diphenylamine)溶于20mL蒸馏水及100mL浓硫酸中。3．操作步骤选取5个稀释度(如10-6~10-2”)的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28℃条件下培养14天后，测定硝酸根的产生。吸取培养液5滴于白瓷板孔中，先加入1或2滴格利斯试剂，如不呈红色，则表示亚硝酸已经完全消失。此时，另吸取培养液5滴于白瓷板孔中+加入1或2漓二苯胺试剂，如呈蓝色，则表示亚硝酸已氧化为硝酸(NO~-)，说明有硝酸细菌的存在。记录测试结果。按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法如需对硝化细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的硝酸细菌培养液着中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的硝化细菌培养液2mL，加入到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40'C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经富集培养的样品进行悬液接种培养。14天后可观察菌落的生长情况。三、反硝化细菌的测定土壤中由于硝化作用所积累的硝酸，在厌氧条件下以NO3或者NO2代替O2作为最终电子受体，被反硝化细菌还原为亚硝酸、氨甚至氮气等，称为广义的反硝化作用。参与这一作用的细菌称为反硝化细菌(denitrifyingbacteria)，也称为硝酸还原细菌。土壤中反硝化细菌多为兼性细菌，测定其数量一般采用稀释平板法。(一)培养基采用反硝化细菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节·五·(九)”。每支试管(1.8cm*l8cm)中装入l0mL培养基(深层培养，以造成厌氧条件)，在培养基中倒放人一小玻璃管(杜氏发酵管)，121~C下灭菌30m(二)实验试剂1)奈氏试剂：同前。2)格利斯试剂：同前。3)二苯胺试剂：同前。(三)操作步骤选取5个稀释度(如10-7—10-3)的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28℃条件下培养14天后，检查是否有细菌生长。如有细菌生长，一般培养液变浊，甚至有时有气泡出现，吸取1或2滴培养液于白瓷板孔中，如加入l或2滴奈氏试剂后出现棕红色或浅褐色沉淀，即表示培养基内有氨产生，同时用格利斯试剂和二苯胺分别检查是否有亚硝酸和硝酸的存在。从测定记录结果，按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和茵的近似值，参见本章第一节“稀释平板法”如需对反硝化细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的反硝化细菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的反硝化细菌培养液2mL，加入到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40~C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经富集培养的样品进行悬液接种培养。14天后可观察茵落的生长情况，并纯化单菌落。如需镜检，可取无菌吸管1支，先用手指压紧管口，放人培养瓶底部，再松手，此时培养液会自动吸人，取出后涂片，经革兰氏染色后镜检，一般用酒石酸钾钠作为碳源的多为革兰氏阴性的细杆菌。四、好氧性自生固氮细菌的测定土壤中的自生固氮微生物，包括好氧性自生固氮菌和厌氧性自生固氮菌、固氮藻类以及一些固定少量氮素的放线苗和真菌等，其中以好氧性自生固氮菌和厌氧性自生固氮菌的固氮能力较大，大气中的氮素占空气的70％，但植物不能直接利用。固氮微生物却具有固定大气中氮素的能力，使气态氮素转变为植物可利用的形态，这对土壤氮索积累及植物氮素营养有重要意义。因此了解它们在土壤中的数量以及活动强度，对研究土壤氮素循环有十分重要的作用。(一)平板培养法1．培养基采用瓦克斯曼77号培养基，或阿须贝无氮琼脂培养基，其具体配方参第四章第三节·五”。2．操作步骤用上述培养基制成平板，每个土样准备培养皿9套。将稀释度(如10-3~10-1)的土壤悬液0.05mL，分别滴加到琼脂培养基的表面，用玻璃刮刀刮匀后，于28'C恒温箱中培养7天后，参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。在此培养基上生长的自生固氮苗的菌落特征是：微微突起，表面光滑或具有皱纹，呈黏液状，有时还呈褐色，不透明，不染成红色，埋藏菌落呈三角形或菱形。镜检细胞肥大，常呈“8”字形，且具荚膜。必须与微嗜氮的微生物加以识别，并最好用化学方法测定其固氮量。(二)稀释法1.培养基采用阿须贝氏培养基，但不加琼脂，其具体配方参见“第四章第三节·五·（一）。将5mL培养基分装于(1．8craXl8cra)试管中，管中贴于内壁放一滤纸条，一半浸入培养基内，一半露于空气中，121℃2．操作步骤选取4个稀释度(如10-4～10-1)的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28'C条件下培养7天后，如滤纸上出现褐色菌落，则表示有自生固氮菌的生长。按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。

如需对好氧性自生固氮菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的固氮菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取该培养液0.05ml，加入到平板上，涂匀，置于28℃温箱中培养7天后观察菌落的生长情况十一、纤维分解菌的测定纤维素(cellulose)是组成植物组织的主要成分，约占植物组织的的％。土壤中植物残体的分解主要是由微生物来进行的，是土壤碳素循环的重要驱动者。纤维素分解菌有好氧与厌氧之分，土壤中纤维素的分解作用主要是由好氧性分解菌进行的，如噬纤维素菌属(Cytophaga)，具有很强的纤维素分解能力。除细菌外，真菌与放线菌的某些类群也具有分解纤维素的能力。在厌氧条件下，分解纤维素的微生物是由一些产孢子杆菌，如奥氏纤维素芽孢杆菌(Bacillusomelianskii)和相类似的少数种进行的。它们不但枉大气碳素循环中有重要作用，而且其分布与土壤性状、土壤肥力有着密切的关系。因此，测定土壤中纤维素分解菌的数量是十分必要的。(一)好氧性纤维素分解菌1、平板法（1）培养基采用赫奇逊培养基，集体培养参见“第四章第三节·五·（五）”。（2）操作步骤分别接种0.05mL稀释度为10-3～10-1的土壤悬液于冷凝的平板培养基上，用玻璃刮刀使其均匀涂抹于培养基的表面。然后用灭菌的镊子夹取灭过菌的直径与培养皿等大的滤纸,覆盖于培养基上,再用干净灭菌的玻璃刮刀压平,置于盛有水的干燥器中,28条件下保湿培养14天后取出，计算黏液菌、弧菌、真菌和放线菌的数量。参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。如需对好氧性纤维素分解菌进一步分离与纯化，可采用划线法纯化单菌落。2．稀释法(1)培养基采用赫奇逊培养基，不加琼脂，其具体配参见“第四章第三节·五·(五)，。将5mL培养基分装于试管(1．80nXl8em)中，管中贴于内壁放一滤纸条，一半浸入培养)R内，一半露于空气中，121~C下灭菌30min。滤纸条是以普通的滤纸剪成5cmXO．7em的纸条。如呈酸性反应，先以碱性溶液(在自来水中加入1或2滴浓碱液即可)，浸泡4—5h，取出用自来水冲洗，烘于使用。(2)操作步骤用5个稀释度(10-5～l0-1)的土壤悬液接种，每管接土壤悬液LOmL，每个稀释度的悬液重复4管。另取4支培养基不接种悬液丽接种无菌水作对照。在接人土壤稀释液时，需经过露于液面的滤纸条流人培养基中。于28~0条件下培养14天，检查各试管中滤纸条上细菌苗落的出现及滤纸变薄、断裂、色素产生情况。从测定记录结果，按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和茵的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果，(二)厌氧性纤维素分解菌(1)培养基采用厌氧性纤维索分解菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节·五·(六)”。将上述培养基10~15mL装于试管中，并插入lcmXlOcm滤纸条一片或加入切成2mmX2mm大小滤纸片0．05g，121~C下灭菌30min。(2)操作步骤用5个稀释度(10—‘一10—’)的土壤悬液接种，每管接土壤悬液1．0mL，每个稀释度重复4管。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28~C条件下培养14天后(加滤纸小片者放一个月)，取出检查滤纸上的溶解区以及菌落或色斑情况，以判别有无厌氧分解菌。加滤纸片者培养一个月后取出振荡观察纸屑腐烂情况。从测定记录结果，按附录中《稀释法四次重复测数统计表》得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。如需继续分离纯化，可用纤维素琼脂培养基，稀释平板法接种，经厌氧培养，可得到厌氧性纤维分解菌的纯培养物。十二、光合细菌的测定光合细菌是一大类具有光合色素，能在厌氧、光照条件下进行光合作用的原核生物的总称，一般生长在湖底土、河流底土、海底土和水稻土等生境中。光合细菌由四个科组成：①着色菌科(红硫菌科，又称红色或紫色硫细菌)；②绿菌科(又称绿硫细菌)；③红螺菌科(又称红色或紫色非硫细菌)；④绿色屈挠菌科(又称滑行丝状绿色硫细菌)。前两个科的光合细菌均为厌氧光台细菌，但着色菌科细菌的硫磺颗粒在细胞内，而绿菌科细菌的硫磺颗粒却在胞外，两者都能以C02作为唯一或主要的碳源，以H2S作为光合反应的供氢体，能源来自日光，属光能无机自养型，后两科的光合细菌都能利用各种有机碳化合物为碳源和光合反应的供氢体，能源来自日光，属光能有机异养型。其中，红螺菌科细苗在有机污水治理、光合细菌饲料蛋白、天然色素以及光合细菌产氢等方面具有广泛的应用前景。因此，本节将介绍土壤中光合细菌的分离、纯化常见方法。(一)培养基(表7—3)7-3光合细菌培养基（二）操作步骤称取60g适于光合细菌生长的土壤，灭菌后装入玻璃量筒内，再加入采集的样品水。根据欲分离的不同光合细菌选用上述相同的培养基100～200mL，并与土壤搅拌均匀，然后加流体石蜡(由液体石蜡和固体石蜡以1：1比例加热混合而成)隔绝空气，造成厌氧环境。在25~35~C温度下，用5000~100001x的光照强度进行光照培养2～8周。这时，光合细菌在玻璃壁上呈菌落状，布满整个筒壁，呈红色或绿色。然后，用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌，移植至约50mL的试剂瓶中，再加入上述培养液，继续培养。用试剂瓶培养时，先装入泥状溶液，再把各种培养液装满瓶子，然后塞紧塞于，，防止培养液溢出，保持厌氧条件。试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长时间培养液蒸发。在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良好的光合细菌悬浮液适当稀释，在厌氧条件下继续进行光照培养。用碱性没食子酸法进行厌氧平板培养，在g000—50001x光照条件下进行。把干燥器内的空气用真空泵减压到]／3，再通人无菌的氢气，进行气体置换造成厌氧条件，然后用碱性没食子酸把残余的氧气除去．把悬液和琼脂培养基混匀后装入已灭菌的细玻璃管中凝固，把玻璃管口两端用橡皮塞塞紧后进行光照培养。培养结束后，在无菌条件下推出凝固琼脂，或打碎玻璃管。将以上分离到的不同形态的菌株进行反复分离纯化，直到在显微镜下观察菌体形态基本一致，纯化工作才结束。菌株供鉴定用。十三、甲烷产生菌的测定大气甲烷是引起全球气候变暖的主要因素之一。大气中的甲烷／L乎有一半来自于富含有机物的缺氧、多水的水田土壤、沼泽、湿地、水底淤泥等厌氧生境的生物过程。这些甲烷在厌氧生境中由产甲烷细菌(methanebacteria)形成以后，经土壤和水层逸散人大气。因此，甲烷产生菌对自然界碳素循环起着重要作用。（一）培养基(表7·4)(二)操作步骤将熔化好装有固体培养基的培养管，放置排列于水温在45~50~C的水浴锅中，每一富集培养处理，排列7或8支，每列前放一支同样组分，仅缺少琼脂的液体培养基，每处理重复1次。每支培养管5mL培养液中，用lmL注射器分别加入1％硫化钠和5％碳酸氢钠混合试剂、青霉素液各o．1mL。把相应基质的富集培养物在旋涡混合器上将富集絮状物打散。用lmL灭菌注射器以氮气流洗去氧后，吸取0．1mL富集培养物，迅速注入加有同一基质的液体培养基中，此管立即在旋涡混合g9上混匀，然后依次同法稀释，每次稀释后均匀混合。稀释程度视富集培养物中产生甲烷细菌的数量而定，以最后2或3个稀释度的培养管中出现10个以下单菌落为宜。在滚管机水槽中加入冰块和冷水，使滚管过程中水温保持较低温度，以便培养管中琼脂培养基迅速凝固。启动滚管机，把巳接入的富集培养物琼脂培养基的培养管平稳放在滚轴与支托点之间，任意均匀转动。待琼脂培养基在培养管内壁凝固成为均匀透明的琼脂薄膜为止。如无滚管机也可在一瓷盘中加水、冰块和少量氯化钠以降低温度，用手滚动进行。30℃十四、有机污染物降解菌的测定土壤中存在大量的微生物资源，它们是土壤环境的净化器，对土壤环境修复发挥着不可替代的作用。因此，土壤中降解菌资源的筛选与分离成为土壤环境微生物修复研究中的重要工作。因此，本节以有机污染物(农药、酚、石油、多环芳烃及有机氯化合物等)为例，介绍土壤中商效降解菌的筛选、分离及纯化常规方法。(一)培养基无机盐含有机污染物培养基(表7—5)(二)操作步骤称取2s有机污染土壤(也可从非污染土壤中筛选)，接种于新鲜的100mL液体无机盐含相应有机污染物的培养基中，在30'C，150r／rain摇床振蔼培养3—5天后，吸取lmL转接至新鲜的上述培养基(必要时，有机污染物浓度也可逐一增加)，连续富集，每周转接1次，多次转接后，用稀释平板分离法在富集培养基上分离，反复划线分离得到菌株。所得菌株重新转接至含有机污染物的无机盐固体培养基上，以验证菌株的降解能力。观察记录菌种的生长状况、菌落特征、镜检菌体的形态结构，以及生理生化和生态特征，革兰氏染色、芽孢染色及鞭毛染色以及菌种鉴定。十五、重金属抗性菌的测定土壤微生物可以积累和转化环境中的重金屑，其中，生物积累机理主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及胞内积累三种作用方式。由于微生物对重金属具有很强的亲和吸附性能，有毒金属离子可以沉积在细胞的不同部位或结合到胞外纂质上，或被轻度整合在可溶性或不溶性生物聚合物上。一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物。同时，重金属进人细胞后，可通过“区域化作用”分布在细胞内的不同部位，体内可合成金属硫蛋白(MT)，MT可通过Cys残基上的巯基与金属离子结合形成无毒或低毒络合物。可见，微生物生物技术在净化污染土壤环境方面具有广泛的应用前景。因此，下面介绍土壤中重金属抗性菌的筛选、分离及纯化常规方法。第八章根圈微生物分析植物根系周围土壤中的微生物数量或种类与根外土壤不同，通常把土壤与根系接触的仅几毫米区域称为根圈(rhizosphere)，又称根际或根围。根圈是微生物发育的一个特殊生境，不同植物甚至不同生育期的同一植物，其根部分泌物都影响着根部周围微生物的发育。根圈微生物的数量往往超过非根圈土壤。根圈和根圈外土壤中微生物的比值又称为根圈效应(rhizosphgeeffect)，通常用R／S值来表示。土壤、植物和微生物三者之间相互影响，关系密切。由于不同土壤及植物根际性质存在差异(如近根区植物细胞脱落、根分泌物、C02、02、pH、水及氧化还原电位等)，它们对根囤微生物会产生显著影响。同时，不同的根圈微生物由于其生理活性及代谢产物的差异也将对土壤肥力及植物营养产生积极或消极的作用。根圈微生物的研究主要是探索它们三者之间的复杂关系，通过对根圈微生物的数量、组成及其动态的调查，以了解微生物的作用及其活动规律。第一节根圈细菌的分析一、根圈的分区由于根圈并非是一个界限分明的区域，要精确区分根圃的范围是困难的。不同的工作者所采用的方法及名称或同一名称的实际含义均有所不同。通常分为二个微区，即根圈及根面区。(一)根圈微生物根圈微生物系指紧密附着于根圈的土壤颗粒中的微生物，当抖动植物根时，这些土粒并不脱离根部，把带有这些土粒的根系在无菌水中振荡一定时间后才能被洗下。在操作时应控制抖动的力度及时间。研究水稻根囤微生物时，可先用水冲去根上大部分土，然后在无菌水中轻轻换洗二次，此时根上保留一薄层土，再把根浸在无菌水中振荡后分离培养获得根圈微生物(rhizospheremicroorganism)。(二)根面微生物根面微生物系指紧贴于活根表面，甚至进入根的表皮组织中的微生物，只有在加入一定量的摩擦剂(如石英砂)的水中经振荡后才被洗下。或把经过根圈微生物分析后的根放入研钵内磨碎后制成悬液，或直接将此根剪成一定长度的小段放于培养基上培养后即可获得根面微生物(rhizosplanemicroorganism)二、根圈细菌的分离(一)样品采集自田间或盆栽内挖取带完整根系的土块(大小依根系范围而定)，同时采用同一块田间无作物的相同深度的耕层土壤，或采不种作物的盆栽土作为根外对照土。根据试验要求，可结合土类、施肥、作物及生育期、作物健壮与否等条件进行采样。把土块用硫酸纸包好，带回实验室，争取当天进行微生物分析。(二)分离方法关于根圈微生物的分离大致有下列两类：1．洗涤法目前最方便的方法是把附着于根上的多余土先抖掉，然后把紧密附着于根上的土粒悬浮于一定容积的稀释液中，按稀释平板法分离，即得根圈微生物。将上述经过洗涤的根转移至第二个含有摩擦剂的无菌水中经过振荡后，再采用稀释平板法分离，即得根面微生物。(1)培养基分离计数细菌可用土壤浸出液琼脂培养基，或根据研究目的采用其他选择性培养基。土壤浸出液的配制方法如下：混合等量的土和水，如加1000mL水至1000g肥土中，如室温下浸24h后，加压(126℃)灭菌20min，加0．5gCaC03过滤，得土壤浸出液；再按下列配方制得土壤浸出液琼脂(表8·表8—1土壤浸出液琼脂培养基（2）操作步骤1)将上述采集的带根土块用小刀把根外大部分土块除去。如土块太干，可先把土块放在盛有适量无菌水的浅盘内浸泡数分钟，使其软化后再除去。2)将根系自土块中取出，轻轻抖动除去松散地附在根上的土粒。3)称取10g根系，置盛100mL无菌水的三角瓶中，振荡t5min，以洗下的土制成根圈土悬液。4)用无菌镊子取出根系，用无菌滤纸吸干，称根重。根系样品洗涤前后的质量差为根圈土的质量。5)将上述洗过根圈土的根系在无菌水中再洗一次，取出，用无菌滤纸吸干，再用无菌剪刀将根剪成小段，称取5.0g根段在无菌研钵中磨碎，然后将碎根全部洗人盛有50mL无菌水(内有5.g石英砂)的三角瓶中，再振荡5mi6)称取10g根外对照土，置盛有100mL无菌水的三角瓶中，振荡15min制成根外土悬液。7)将上述悬液以10倍稀释法分别稀释成一系列的稀释液(10-8～10-2)，再按稀释平板法分别从稀释液取样，接种培养，计数。如把培养皿于厌氧条件下培养，则可得厌氧菌。2、直接观察法应用洗涤法可进行根圈微生物的数量、组成测定及分离鉴定，但看不到根部不同区域内微生物的分布状况。只有用直接观察法或用印片法才能获得这些资料。Rossi(1927)及Cholodny(1930)用埋片法进行根圈微生物的研究，即把玻片埋人土中与植物根相接触，于不同时期把玻片取出，染色镜检观察生长的根对特殊微生物发育的影响。Foser等(1973)用电子显微镜对小麦根圈的超薄切片进行检查，能看到微生物区系、根与土壤之间的空间关系。这为观察微生物占领根部、从根释放有机物、从土壤扩散营养物至根的途径等过程提供了初步资料。具体方法详见第十四章有关部分。三、根圈优势菌株的分群根囤及根面上的微生物组成是很复杂的，在对其数量有了一定认识之后，应对它们进行纯培养及种的分群，因此从根圈及根面的优势菌着手是适宜的。以在最高稀释度平板上出现的5—10个菌落作为在根圈及根面的优势菌。为了掌握合适的稀释度，可用血球计数板测得第一个稀释液中的细菌概数，然后再进行稀释平板分离。将分离所得优势菌移植于土壤浸出液琼脂斜面上，并进行编号、纯化。然后分别进行革兰氏染色及形态观察。(一)营养型的区分分别在下列培养基中进行培养观察，以检查各菌对营养的需求并依次归为不同的营养型。1)Ashby或其他无氮培养基(见第四章第三节)。2)基础培养基(表8—2)。表8-2基础培养基3)氨基酸培养基。基础培养基十0．4％干酪氨酸。4)生长素培养基(表8—3)。表8-3基础培养基+下列成分5)氨基酸十生长素培养基。基础培养基+上列3)、4)中的氨基酸及生长素。6)酵母浸液培养基。每1000mL基础培养基+1.0g?)土壤浸液培养基。基础培养基(750mL)+土漫液(250mL)。8)酵母膏+土漫液培养基。每1000mL土浸培养基十1.0g酵母漫膏。(二)细菌形态及营养型区分标准根据镜检和生长浊度观察，确定其形态及营养型。(1)形态类型(2)营养类型1)可能固氮的菌。2)要求简单的菌。3)要求氨基酸的菌4)要求生长素的菌5)要求氨基酸及生长素的菌。6)要求酵母膏中未鉴定物的菌?)要求土浸液中未鉴定物的菌8)要求酵母膏及土浸液中均未鉴定物的菌。根据工作要求可进一步对优势菌进行鉴定和其他生理活性(如固氮、溶磷)进行测定，也可以进行它们对作物幼苗有无刺激作用以及对其他微生物有无颉颃作用等项研究。第二节植物组织内微生物的分离土壤中有多种微生物可以由植物根部入侵并在植物体内与其共生或寄生。为了确定这些微生物的种类，研究其形态，生理和生态特性及其入侵机制等，必须选择适当材料经过组织表面消毒后，用选择培养基分离得到目标菌的纯培养物。一、植物材料的选择分离豆科或非豆科植物根瘤菌时要选择生长健壮、瘤多、瘤大的植株，取主根上大而色泽红的鲜瘤。分离植物组织内病原菌时要以新近发病的植株、器官或组织作为分离材料，以减少腐生菌污染。二、组织表面消毒先用水充分洗去组织表面的土壤或其他杂质；再用70％乙醇溶液浸泡2～3s，利用乙醇表面张力小易铺展的特点，除去组织表面的气泡，或者在表面消毒剂中加入少量吐温20等表面铺展剂使消毒剂易与植物组织直接接触。常用的组织表面消毒剂如下：1)升汞(HgCl2)是常用的剧毒表面消毒剂。通常采用o．1％升汞水溶液作消毒用。配方如下：升汞1．08浓盐酸(HCD2．5mL蒸馏水1000mL有时配成一定浓度的原液储存，用时再稀释。原液配方；升汞20g，浓盐酸100mL，用时取原液5．0mi。加水995mL稀释。盐酸可以增加升汞溶解度以防止沉淀的产生，并有增强杀菌力的作用。由于升汞溶液无色、无味而又剧毒，通常在溶液中加数滴染料以便识别。表面灭菌所需时间因材料而不同，自30s至30min不等，通常用3~5min，材料经表面灭菌后必须用灭菌水换洗3或4次以除去组织表面残留的升汞。2)漂白粉。配制方法如下：漂白粉10g蒸馏水140mL配制后过滤使用。漂白粉加水溶解后放出的新生氯[Ca(ClO)2+H20→Ca(OH)2+C12]具有强烈的杀菌作用。因新生氯易挥发，应在临用前配制，而且其残毒不大，灭菌后可不再用灭菌水洗。3)次氯酸钠(NaCl0)。也是利用其新生氯杀菌。一般次氯酸钠中活性氯含量不少于5．2％，通常采用1；(3～5)次氯酸钠水稀释液作表面灭菌用，稀释后立即使用，灭菌后的植物组织也可不必再用灭菌水洗。4)其他的表面消毒剂。l％苯酚，5％福尔马林，3％过氧化氢，o．1％氰化汞，2％高锰酸钾，o．1％硝酸银等。灭菌时间因植物组织的划、、发育程度而异。幼嫩组织若在消毒剂中浸泡时间过长则可能杀死组织内欲分离的病原菌，因此，安全的办法是不用药剂消毒，而用灭菌水换洗8或9次，以除去表面附着的杂菌。而较大的材料或表面组织坚硬的材料可将乙醇涂在其组织表面，然后在火焰上烧着乙醇，灼热灭菌。5)还有一些沸点低、易气化、可用作熏蒸杀菌的药剂作为组织表面消毒剂。如环氧乙烷(ethyleneoxide)，沸点10.8℃，杀菌作用很强，但使用不安全。环氧丙烷(propylene三、分离方法(一)组织分离法取经过表面灭菌的组织少许，置琼脂平板上培养，长出菌落后，在菌落边缘挑取少量菌体移植于琼脂斜面上，在一定温度下培养后获得所分离的培养物。(二)稀释平板分离法主要用于分离细菌、酵母苗或产孢子多的真菌。分离组织内细菌时，例如，在分离根瘤菌时，将经过表面灭菌的根瘤放在灭菌培养皿内，用镊子将瘤挤碎，取其汁液用稀释平板法(第七章第一节)或划线法分离单个菌落。若分离组织表面产孢多的真菌时，可将孢子用无菌水洗下，再用上述两种方法分离，即可从单个苗落获得纯培养物。(三)蔗糖浓度梯度分离法在植物根部组织内可能含有不只一种微生物，而fR37离的菌在一般蜘自平板上生长缓慢的情况下，采用通常的稀释平板法往往难以分离目的物。有人用不同浓度的蔗糖溶液制成蔗糖浓度梯度柱后，加含有微生物的悬液于其上，离心后相对密度不同的微生物沉降在蔗糖柱不同深度而分离开来，分层取样后在乎板上培养获得纯培养物。例如，从牛奶子(Elaeagnusumbelllata)及绿桤木(Alnusviridis)根瘤中分离Frankia时常用此法。现将Baker等(1979)的方法介绍如下；，1)取鲜瘤0．25g，用水洗去泥土。2)在含活性氯5．25％的次氯酸钠30％(v／y)水溶液50mL中加l滴吐温20作为表面铺展剂，灭菌15min。3)用灭菌水洗瘤2次，挤碎，加适量灭菌水研碎后，用玻璃棉过滤。将过滤液取出，加灭菌水至lOmL，制成茁悬液待用。4)离心管用95％乙醇灭菌后风干，用加热灭菌的蔗糖溶液制成梯度浓度：60％(m／V)lOral，45％3．Oral，30％6．OmL，依次顺管壁徐徐加入管中制成梯度的蔗糖柱。5)加2．Oral茵悬液于蔗糖柱上部。加溶液或悬液时注意勿使各层溶液相混。然后在4℃、100000g6)用虹吸法或穿刺法分层取8个不同梯度溶液各1.0mL，分放在选择培养基琼脂平板上，培养后分离单个菌落获得纯的培养物。第十五章土壤微生物生物量的测定土壤微生物生物量(soilmicrobialbiomass)是指土壤中体积小于5／~rn3的活微生物总量，是土壤有机质中最活跃和最易变化的部分。耕地表层土壤中微生物生物量碳一般仅占土壤有机碳总量的1％~3％。土壤微生物生物量与土壤中的C、N、P、S等养分的循环关系密切，可直接或间接反映土壤肥力和土壤环境质量变化。目前土壤微生物生物量测定应用较为广泛的方法主要有熏蒸提取法、底物诱导法，三磷酸腺苷(ATP)法及真菌麦角甾醇分析法等。本章将对上述几种方法基本原理和操作步骤作一系统介绍。第一节土壤样品采集与预处理土壤样品的采集方法和要求基本上与土壤其他性质的要求相同。采集到的新鲜土壤样品应及时拣出土壤中的可见植物残体、根系及土壤动物(如蚯蚓)等，然后迅速过筛(<2mm)，充分混匀，装袋，立即分析或保存于4℃冰箱中备用。如果土壤水分含量较高，无法过筛，应在室内避光处自然风干再过筛，风干过程中须经常翻动，避免局部干燥影响微生物的活性。过筛的土壤样品调节土壤含水量至田间持水量(water-holdingcapacity，WHC)的40％左右．将土壤置于密闭容09中预培养7—15天，密闭容器内放人两个适中烧杯，分别加入水和稀NaOH溶液，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，或保存于4℃土壤田间持水量采用改进的Shaw(1958)方法测定，即在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。取50．os土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50mL水，静止30min，然后打开夹于将多于的水放人量筒，静置30min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干基表示。第二节土壤微生物生物量碳分析土壤微生物生物量碳是指土壤中所有活微生物体中碳的总量，通常占微生物干物质的40％~50％，是反映土壤微生物生物量的重要微生物学指标。传统的土壤微生物生物量测定是基于分离计数法，根据各类微生物数量及大小再折算成干物质质量。但是这种方法不仅费力、耗时，而且目前常用的方法技术仪能观测到部分土壤微生物，其应用范围受到极大的限制，不能准确地测定出土壤微生物生物量。针对这一问题，Jenkinson和Powlson等(1976)最先提出井建立了土壤微生物生物量碳的熏蒸培养法，为土壤微生物生物量的测定找到一种较为方便的间接方法。但是，该方法对熏蒸灭菌、熏蒸后去除氯仿及培养装置的密封性、培养条件和时间需要严格的要求，而且培养时间较长，不适宜样品的大批量分析。在此基础上，Vance等(1987)则建立了土壤微生物生物量碳的氯仿熏蒸0.5mol／LK2S04提取——容量分析法。之后，Wu等(1990)对土壤0．5mol／LK2S04的提取液有机碳分析方法进行改进，又建立了氯仿熏蒸0.5mol／LK2S04提取——仪器分析法，该方法更为快速、简便、精确，适于大量样品分析。一、熏蒸提取——容量分析法(一)基本原理(二)实验设备油浴消化装置(包括油浴锅和铁丝笼)、可调温电炉、秒表、自动控温调节器、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯蛆料管、离心管、漏斗等，(三)实验试剂1、无乙醇氯仿(CHCl3)普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去，将氯仿试剂按1：2(体积比)与蒸馏水一起放八分液漏斗中，充分摇动lmin，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤三次。得到的无乙醇氯仿加入元水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，避光保存于4~C冰箱中。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。2．硫酸钾(0。5mol／L)溶液称取硫酸钾(KzS04)87．10g，溶于去离子水中，稀释至1000mL。3、重铬酸钾(0．018nml／L)—硫酸(12mol／L)混合液称取5．30g分析纯重铬酸钾溶于400mL去离子中，慢慢加入435mL分析纯浓硫酸，边加边搅拌，冷却至室温后，用去离子水定容至1000mL。4．重铬酸钾（0.05mol／L）标准溶液称取经130~C烘干的重铬酸钾(K2CrO7，GB642--77，分析纯)2．4515g溶于水中，定容于1000mL容量瓶中。5．邻啡哕啉指示剂称取L49g邻啡哕啉溶于100mLo．?％分析纯硫酸亚铁溶液。密封保存于棕色试剂瓶中。6．硫酸亚铁(0．05mol／L)溶液称取13．9e硫酸亚铁(FeS04·7HzO，GB664--77，分析纯)溶于800mL水中，慢慢加入浓硫酸5mL，稀释至lml，保存于棕色试剂瓶中。此溶液易被空气氧化，使用前应标定。标定方法：取20．00mL上述0．05mol／L重铬酸钾标准溶液于150mL三角瓶中，加3mL浓硫酸和1滴邻啡哕啉指示剂，用硫酸亚铁溶液滴定至终点，根据所消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度。(四)操作步1)称取新鲜土壤(相当于于土50．0g)3份分别放人3个100mL烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿(约2／3)的25mL烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5min。关闭真空于燥器阀门，于25~C黑暗条件下培养24h。2)熏蒸结束后，打开真空千燥器阀门(应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做)，取出盛有氯仿(可重复利用)和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空(5或6次，每次3rain，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子)，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤置于另一干燥器中，做不熏蒸对照处理。3)从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到200mL聚乙烯塑料管中，加入100mL0．5mol／L硫酸钾溶液(土水比为1：4)，300r／rain振荡30nfin，用中速定量滤纸过滤。同时也设3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或一20℃4)吸取上述土壤提取液于150mL消化管中，准确加入10mL重铬酸钾(0．018mol／L)—硫酸(12mol／L)混合液，再加入3或4片经浓盐酸浸泡过夜后洗涤烘于的瓷片<以防瀑沸)，混匀后置于油浴消化装置中煮沸10min。冷却后转移到150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3～5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻啡哕啉指示剂，用o．05mol／L硫酸亚铁标准溶液滴溶液颜色由橙黄色变化为蓝绿色，再变为棕红色即滴定终点。(五)结果计算有机碳量(μgC／g)=[12*l03*(Vo—V)*M*f]／W式中，M为FeS04标准溶液浓度(mol／L)；vo、y分别为空白和样品消耗的FeS04溶液体积(mL)；f为稀释倍数；W为烘干土壤重量(g)；12为碳原子的毫摩尔质量(g)；103为换算系数。土壤微生物生物量碳：Bc＝Ec／kec式中，Ec为熏蒸和未熏蒸土壤的差值；kec为转换系数，取值0.38(Vanceeta1.，1987)。二、熏蒸提取——仪器分析法（一）基本原理新鲜土壤经氯仿熏蒸后(24h)，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的o．5m01／LK，S04溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳量的差值及转换系数(kin)，从而计算土壤微生物生物量碳。(二)实验仪器自动总有机碳(TOC)分析仪(ShimadzuModelTO&500，JAPAN)、真空千燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、滤纸、漏斗等。(三)实验试剂1)无乙醇氯仿(CHCl3)：同前。2)0．05mol／L硫酸钾溶液：同前。3)工作曲线的配制：用0．5mol／L硫酸钾溶液配制10μgC/L、30μgC／L、50μgC／L、70μgC／L、100μgC／L系列标准碳溶液。4)去离子水或蒸馏水。(四)操作步骤1)称取新鲜土壤(相当于干土10．g)3份分别放人3个25mL小烧杯中。将烧杯放人真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿(约2／3)的15mL烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放人一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5min。关闭真空干燥器阀门，于25V黑暗条件下培养24h。2)熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门(应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做)，取出盛有氯仿(可重复利用)和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空(5或6次，每次3mln，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子)，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。3)从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将士样完全转移到80mL聚乙烯离心管中，加入40mLo．5mol／L硫酸钾溶液(土水比为1；4)，300r／min振荡30rain，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或一20℃4)吸取上述土壤提取液loPL注入自动总有机碳(TOC)分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪(~imadzuMod—e1TOC--500，Japan)为例，介绍其测定过程如下：1．开机预热1)插上电源，打开机身后面的电源开关，然后再打开前面的“Main'’开关，如无异常，再打开“Furnance”开关。2)按面板上“Range'’键，设定量程为“X10”3)打开高纯空气阀门，调节压力阀门至lkg／c~，再调节机身后面的空气流量为150mL／min。4)约30~60min预热后，见“Ready”指示灯开始闪烁，表明可以开始测定。2、标准曲线设定1)按“ANAL／COND”键，机器打印出TOC-500，ANADCOND，DATE等，如需改动日期，则输入所需日期，然后按“ENT”键；如不改动，直接按“ENT'’键；打印出"RANGEXl0”或X3或X¨按“ENT'，键，打印出FLOW，150mL／min，再按“ENT”键，打印出INJ—2)设定标准溶液高浓度值：按“STD／HIGH”，然后按测定值，再按“ENT”键。3)测定高浓度标准曲线溶液：按“TC'’键，用微量注射器注射所需体积的高浓度标准溶液，2～3min后打印出测定的峰面积，重复测定3或4次，再按编号值和“ENr’键，打印出平均值。4)设定标准溶液低浓度值：按“STD／LOW”，再输入低浓度值，再按“ENT'’键。3．样品分析1)按“SAMPLE／NUMBER”，再输入编号(如01～50号)，再按“ENT'’键后，即可注射测定。2)如样品浓度过高，则需稀释，输入稀释倍数，再按“ENT”键。3)只有当“READY”指示灯闪烁时，才可进行另一个样品测定，否则按“ENT'’键使之闪烁。4.关机先关“Furnance”开关，15rain后，关闭高纯气体阀门，最后关“Main'’开关和电源开关。并作好清洁工作。(五)结果计算土壤微生物生物量碳：Bc＝Ec／kec式中，Zc为熏蒸和未熏蒸土壤的差值；km为转换系数，取值为o．45(Wuetal+1990)。第三节土壤微生物生物量氮分析土壤微生物生物量氮是指土壤中所有活微生物体内含有的氮的总量，仅占土壤有机氮总量的l％～5％，是土壤中最活跃的有机氮组分，其周转变化对土壤氮素循环及植物氮素营养起着重要作用。土壤微生物生物量氮的测定继承了微生物生物量碳的熏蒸提取过程，目前主要是采用熏蒸提取——全氮测定法和熏蒸提取茚三酮比色法两种。本节将对这两种方法作较为详细的介绍。一、熏蒸提取——全氮测定法(一)基本原理新鲜土壤经氯仿熏蒸后(24h)，矿化速度加快，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量氮，用一定体积的o．5mol／LK2S04溶液提取土样，样品在混合催化剂的参与下，用浓硫酸消煮使微生物态氮经过复杂的高温分解反应转化为氨，与硫酸形成硫酸铵，碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以标准酸溶液滴定，求出土壤微生物生物量氮含量。根据熏蒸土壤与来熏蒸土壤测定有机氮量的差值及转换系数(kin)，从而计算土壤微生物生物量氮。(二)实验设备消煮炉、半微量定氮仪、半微量滴定管、硬质消化管、可调温电炉、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯甥料管、离心管、漏斗等。(三)实验试剂1)无乙醇氯仿(CHCl3)：同本章第二节。2)o．5mol／L硫酸钾(K3S04)溶液：同本章第二节。3)浓硫酸："＝1．84g／mL，化学纯。4)10mol／L氢氧化钠(NaOH)溶液：称取420g固体NaOH，于硬质玻璃烧杯中，加蒸馏400mL溶解，不断搅拌，以防止烧杯底角固结，冷却后倒人塑料试剂瓶，加塞，防止吸收空气中的CO。，放置几天待NagC03沉降后，将清液虹吸入盛有约160mL无CO：的水中，井以去CO2的蒸馏水定容1000mL加盖橡皮塞。5)甲基红—澳甲酚绿混合指示剂；0．5g溴甲酚绿和0．1g甲基红溶于100ml。乙醇中，6)20g／LHzB03—指示剂，20gHzBOa(化学纯)溶于1000mL水中，每升H2B03溶液中加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂5mL，并用稀酸或稀碱调节至微紫红色，此时该溶液的pH为4．8。指示剂用前与硼酸混合，此试剂宜现配，不宜久放。7)混合加速剂：K2S04：CuS04tSe’100：10：1，即100gK2SO,㈠七学纯)、10gCuS04·5H20(化学纯)、和1sSc粉混合研磨，通过80号筛充分混匀(注意戴口罩)，储于具塞瓶中。消煮时每毫升H：S04加o．37g混合加速剂。8)0．02mol／L(1／2H：S04)标准溶液：量取H：S04(化学纯、无氮、ρ＝1.84g／ml)2.(四)操作步骤1）称取新鲜土壤(相当于干土10．0g)3份分别放人3个25mL小烧杯中。将烧杯放人真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿(约2／3)的15mL烧杯2或3只，烧杯内放人少量防暴沸玻璃珠，同时放人一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃2)熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门(应听到空气进入的声音，否则熙蒸不完全，重做)，取出盛有氯仿(可重复利用)和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空(5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子)，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。3)从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将士样完全转移到80mL聚乙烯离心管中，加入40mL0．5mol儿硫酸钾溶液(土水比为l；4)，300r／min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或一20℃4)吸取20mL土壤浸提液于50mL凯氏瓶中，加入0．5mL浓H2SO4，以防铵损失。在水浴中加热至体积减少l~2mL。然后加入3g混合加速剂(K2SO4：CuS04：Se＝90：9：1)和8mL浓H2S04，摇匀，在340℃5)吸取20mL消煮液于蒸馏瓶中，置盛有5mL硼酸指示剂液的三角瓶于冷凝管下端。加20mL40％NaOH溶液于蒸馏瓶中进行蒸馏，直到馏出液体积达50mL左右，停止蒸馏，用少量水冲洗冷凝管下端，取下三角瓶，用酸标准溶液滴定，使其终点达紫红色。同时进行空白试验