基因工程制药技术 基因工程常用工具

生化制药工艺AcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplan项目五基因工程制药1基因工程的概念2基因工程操作工具3基因工程操作流程目录CONTENTS基因工程常用工具02Part2基因工程操作工具一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶

“分子缝合针”----DNA连接酶“分子运输车”----载体Part2基因工程操作工具二、限制性内切酶1、工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基Part2基因工程操作工具二、限制性内切酶2、限制性内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因工程技术中常用Ⅱ型作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA命名命名Hin

dⅢ

属

种

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写第四个字母代表株罗马数字表示发现的先后次序Part2基因工程操作工具二、限制性内切酶2、限制性内切酶识别位点----回文结构（palindrome）双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列切口平端切口粘端切口GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性内切酶2、限制性内切酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点GGATCCCCTAGG+BamHⅠGCCTAGGATCCGBstⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性内切酶2、限制性内切酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端（compatibleend）BglⅡ+BamHⅠ+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGAGATCTTCTAGAATCTAGGATCTAPart2基因工程操作工具二、DNA连接酶1、DNA连接酶作用和分类作用催化形成3,5-磷酸二酯键分类E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低热稳定的DNA连接酶从嗜热高温放线菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分离纯化的，一种能够在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接作用的一种核酸酶Part2基因工程操作工具二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比连接酶底物辅助因子和激活因子温度巯基试剂黏性末端平末端DNA-RNA杂合体RNA-RNA杂合体大肠杆菌DNA连接酶可行可行不行不行NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）黏性末端：10~15℃补平缺口：37℃无T4DNA连接酶可行可行可行可行ATP，Mg2+（10mmol/L）黏性末端：4℃平末端：10~25℃补平缺口：37℃DTT嗜热菌连接酶可行不行不行不行NAD+，Mg2+(10mmol/L)黏性末端：24~37℃补平缺口：65~72℃无Part2基因工程操作工具三、基因载体1、载体定义和分类定义能携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子为什么要利用载体游离的DNA进入细胞体,一般会直接被分解,就算可以进行转录----翻译成蛋白,游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因分类克隆载体（cloningvector）为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体表达载体（expressionvector）为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体穿梭载体用于真核生物DNA片段在原核生物中克隆和鉴定（容易），然后在真核细胞宿主表达Part2基因工程操作工具三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体