气相色谱测定-葡聚糖和甘露聚糖的含量

气相色谱测定-葡聚糖和甘露聚糖的含量

葡萄糖是由葡萄糖元通过i-1、3-和i-1和4-糖苷键连接的相同糖含量的葡萄糖。主要来自葡萄糖的母亲。它是葡萄糖母亲体内的主要成分。它存在于红细胞的内部，占螺母细胞干物质的26%30%。β-葡聚糖是一种良好的生物效应调节剂,能增强哺乳动物的免疫力,在抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗真菌、降血脂等方面也有很强的活性,已广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。由于β-葡聚糖是碱不溶性多糖,并与甘露聚糖、蛋白质等物质相互结合,所以其精确定量测定一直是研究中的难题。目前文献中已报道的β-葡聚糖主要测定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和高效液相色谱法(HPLC)等,它们都是以测定β-葡聚糖水解后葡萄糖含量为基础的。其中苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法直接测定总还原糖含量从而得出β-葡聚糖含量,这忽略了酵母细胞中除葡萄糖外的其他还原糖(如五碳糖)的存在,从而使得测定结果不准确;对于HPLC法,分析中采用的示差检测器对于碳水化合物的灵敏度很低,并且各种单糖之间的检测差异很小,对HPLC色谱柱的要求较高,一般色谱柱不易分离,因此也不实用。本文借鉴了一些植物多糖中单糖组分的分析方法,采用气相色谱法直接测定葡萄糖含量,具有分析速度快、选择性强、灵敏度高和测定结果精确可靠等优点,从而为啤酒酵母中β-葡聚糖含量的测定提供新参考。1材料和方法1.1仪器、试剂与仪器啤酒酵母广州市珠江啤酒厂;β-葡聚糖日本ADEKA株式会社;风味蛋白酶、Alcalase2.4L诺维信公司;丙酮、三氟乙酸、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐等天津市化学试剂一厂,分析纯;标准葡萄糖、甘露糖上海源聚生物科技有限公司,分析纯。GC-2014气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器FID日本岛津公司;KQ-250DE型数控超声清洗器昆山市超声仪仪器有限公司;雷磁PHS-3C精密pH计上海精科仪器有限公司;N-EVAP111型氮吹仪美国Organomation公司;5804R型高速冷冻离心机德国Eppendorf公司;RE-52型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(III)型循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司;HHS型电热恒温水浴锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂。1.2实验方法1.2.1-葡萄糖的制备1.2.1.碱性蛋白酶酶解离心分离新鲜啤酒酵母→200目过筛除去啤酒花等杂质→水洗除去剩余啤酒→离心分离→将沉淀溶于水配成反应体系进行自溶→加盐破壁→碱性蛋白酶酶解→离心分离→水洗沉淀→脱色脱脂→冷冻干燥→粉碎→成品1.2.1.催化氧化反应自溶,在pH7.0环境中,按反应体积1%的量加入风味蛋白酶,50℃下反应24h;破壁,在pH10.5环境中,按反应体积3%的量加入NaCl,搅拌混匀,80℃下保持1h;酶解,在pH10.5环境中,按反应体积1%的量加入Alcalase2.4L,搅拌混匀,80℃下反应3h。1.2.2利用露天气溶剂测定讨论1.2.1方法制备的β-葡聚糖成品中可能还有些其他物质,如甘露聚糖和蛋白质,其中甘露聚糖是由甘露糖构成的同一聚糖,本实验同时测定甘露聚糖的含量,为β-葡聚糖含量的测定提供参考和对照。1.2.2.糖腈乙酸酯衍生物的衍生化反应葡萄糖和甘露糖的沸点很高,若直接进样分析,一方面在色谱柱的可耐受温度内很难分离,另一方面单糖的异构峰对分析也会产生干扰,因此需要进行衍生化降低其沸点,使之能在较低温度下分离出,同时消除单糖异构峰对分析的影响,从而避免误差。本实验采用乙酰化作为衍生化方法,即制备单糖的糖腈乙酸酯衍生物,其反应原理是:标准单糖和盐酸羟胺在溶剂吡啶中加热反应生成糖肟,以乙酸酐作为乙酰化试剂,在加热条件下继续反应,最后生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物。准确称取10mg固体单糖标准品(先在105℃下烘干至恒重)、10mg盐酸羟胺于1.5mL小离心管中,加入0.5mL吡啶,放入90℃水浴中加热反应30min,间歇振荡。取出后冷却至室温,加入0.5mL乙酸酐,90℃下继续水浴加热反应30min,离心后取适量上清液直接进行气相色谱分析。记录每种单糖的保留时间。按照上述方法,将两种标准单糖分别进行衍生化反应。1.2.2.标准曲线的绘制准确称取标准葡萄糖和甘露糖各10mg,按1.2.2.1方法乙酰化后,葡萄糖和甘露糖衍生物浓度同为10mg/mL,分别将此浓度葡萄糖和甘露糖衍生物按比例混合,配制成1、2、3、4、5mg/mL的混合糖液,同时做空白对照,立即进行气相色谱分析,记录色谱峰面积,以其为纵坐标,并以混合糖液中每种糖的浓度为横坐标,绘制标准曲线。1.2.2.氟乙酸残留对三氟乙酸的去除准确称取10mg多糖粉末于10mL离心试管中,加入2mL75%三氟乙酸,封管,90℃下水浴3h,间歇振荡,待酸水解完取出,将试管接入氮吹仪在80℃下蒸干,再加入1mL甲醇再次蒸干,重复3次,以去除残留三氟乙酸。对水解单糖按1.2.2.1方法衍生化后立即进行气相色谱分析,记录两种单糖的保留时间和对应的峰面积,代入标准曲线中计算出样品中葡萄糖和甘露糖的精确含量。1.2.2.升温程序及设备气相色谱柱:DB-17石英毛细管柱(30m×0.32mm,液膜厚0.25μm,Agilent);升温程序:初温为160℃,以5℃/min升温至180℃,再以2℃/min升温至210℃,保留5min;进样口温度:230℃,检测器温度:250℃;载气(氮气)流速:20mL/min,氢气流速:45mL/min,空气流速:400mL/min;分流比20∶1,进样量1μL。2结果与讨论2.1衍生化产物的提取乙酰化后,标准葡萄糖和甘露糖衍生物的气相色谱分析结果如图1所示,分析表明采用糖腈乙酸酯衍生化的方法,一种单糖只对应一种衍生化产物,在较低的200℃下即可分离出来。两种标准单糖衍生物保留时间分别为14.347min和15.016min,分析表明在1.2.2.4所采用的气相色谱条件下,混合单糖中的两种单糖出峰时间短,峰形对称,隔得较开,并未出现拖尾现象,可以得到较好的分离。2.2葡萄糖衍生物标准曲线方程,利用面线根据标准葡萄糖和甘露糖衍生物标准曲线绘制的操作步骤,可作出如图2和图3所示的标准曲线,其中葡萄糖衍生物标准曲线方程为A=750574C-16767,R2=0.9996,甘露糖衍生物标准曲线方程为A=775995C-1410.7,R2=0.9999,线性非常好。从曲线趋势来看,两种单糖衍生物出峰面积随着糖浓度的增大而呈线性增长。2.3两种单糖的质量检测比较ADEKA株式会社是日本最大的β-葡聚糖生产公司,这里将其进口产品与本实验室制备的成品中葡聚糖和甘露聚糖含量进行比较,将两种样品水解并乙酰化后,按与混合标样相同的色谱分析条件进行气相色谱分析,结果分别如图4和图5所示,其水解单糖保留时间与标准混合单糖的保留时间对比分析表明,水解后的两种单糖分别为葡萄糖和甘露糖,其中葡萄糖含量较高。2.4不同种类葡萄糖和利用地域的特征根据样品中水解后每种单糖气相分析的峰面积,代入葡萄糖和甘露糖的标准曲线,可算出葡萄糖和甘露糖的浓度,进一步计算出样品中葡萄糖和甘露糖含量,从而最终得到β-葡聚糖和甘露聚糖的含量,计算结果如表1所示。从表1可以看出,实验室制备的β-葡聚糖和甘露聚糖与日本进口β-葡聚糖和甘露聚糖的含量都比较接近。2.5露聚糖含量的相对标准偏差精密称取10mg实验室制备的产品,按上述相同方法进行处理和测定,平行测定3次后,结果如表2所示,β-葡聚糖和甘露聚糖含量的相对标准偏差分别为5.09%、6.25%,均小于一般仪器法所要求的相对标准偏差值10%。根据2.4测定结果,每10mg样品中β-葡聚糖和甘露聚糖含量分别为3.239mg和1.682mg,分别添加5mg葡萄糖和甘露糖进行测定,结果如表3所示,加标回收率在87.14%～101.2%之间,说明该方法准确性高,能够满足检测要求。3色谱柱的选择本实验建立的啤酒酵母β-葡聚糖含量的气相色谱测定法,前处理简单、操作方便、重现性好、选择性强、精密度高,符合实验室对β-葡聚糖含量测定方法的要求。在这个分析过程中要注意:第一,糖类的衍生化方法要求制备简便、试剂易得,而且每种单糖要得到单一的色谱峰,这对单糖的定量分析是十分重要的;第二,色谱柱对于分离效果也很重要,在气相条件探索过程中,比较了AC-5(非极性)和DB-17(中极性)两种毛细管色谱柱,发现AC-5出峰慢,分离不