超氧化物歧化酶在啤酒生产中的应用

超氧化物歧化酶在啤酒生产中的应用

超氧化物诱导酶（ec.1.1.1，super-sod）广泛存在于生物中。这是目前科学研究中一套具有金属元素的活性酶。1938年,Mann和Keilin首次从牛红血球细胞中分离出SOD,1969年美国I.Fridovich教授和他的研究生McCoard再次发现了这种蛋白,并证实了其生物催化的酶活性,弄清了它催化超氧阴离子发生歧化反应的性质,并正式命名为超氧化物歧化酶。O2称为超氧阴离子自由基,是生物体多种生理反应的中间产物。它是活性氧的一种,氧化能力极强,是生物氧毒害的重要因素之一。SOD具有特殊的生理活性,能清除生物体内自由基。在生物体内已发现的有Cu、Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD,它们都可将O-2歧化为H2O2和O2,具有清除氧自由基的能力。SOD在啤酒生产中的研究及应用在国外很早就有报道,国内相关报道却不多。大量研究证明,SOD对啤酒生产的全过程及成品啤酒的抗氧化都具有重要的作用。1糖酸氧合物和氧化剂的整合超氧化物歧化酶在啤酒生产中的研究开始于对啤酒风味老化问题的处理。啤酒风味的老化是氧自由基及其引起的一系列氧化还原反应所造成的。早在上个世纪中叶,国外的酿酒师们就已经认识到啤酒的变质是由于空气的作用使啤酒发生了氧化。廖惟等关于氧原子的经典实验中,在瓶装啤酒的瓶颈空气中引入18O2,经过一段时间的贮藏后,发现65%的18O原子被整合进入多酚分子中,5%被整合进入异α-酸的衍生物中,30%被整合进入挥发性羰基化合物。这不仅证明了羰基化合物是成品啤酒与其风味老化相关的最重要的一类物质,更证明了成品啤酒瓶中的溶解氧和瓶颈处的空气促使了啤酒的氧化。后来人们在整个工艺流程上严格除氧:发酵罐和清酒罐及一切与酒液接触的辅助罐的备压用CO2或N2,硅藻土调浆用脱氧水,调浆罐内覆盖惰性气体,酒头要控制,酒液输送要缓和,灌酒机酒缸的背压用CO2,并经数次抽真空,减少了瓶内氧气等措施,使包装酒的总氧含量在0.1mg/L以下。美国加州一家公司将能结合氧分子的类似血红蛋白的物质放入啤酒瓶盖中,制出了防止啤酒氧化失鲜的瓶盖。尽管工艺上采取了这些措施,啤酒的氧化仍然不可避免。人们开始设想酒的氧化作用可能发生在制麦和糖化工序之前,形成的氧化风味败坏物质(醛类)与其他酒的成分(二氧化硫等)形成了加合物而暂时被掩盖起来,并在发酵时避免了酵母的还原。包装之后,随着时间的延长,与醛类结合的SO2逐渐消失,醛类再度被游离出来,使啤酒出现劣味。所以对啤酒风味老化问题的处理追溯到了啤酒生产的过程中。2啤酒中的氧自由基啤酒老化的关键因素是氧化,而氧化的根本则是氧。氧在啤酒生产工艺流程中一直处于一个尴尬的地位,它既有好的一面,又存在有害的一面。在啤酒生产的前期,氧对大麦的发芽是必需的;在啤酒发酵阶段,氧又参与酵母的合成和细胞膜的维持,需要在麦汁中添加酵母时人为的充入氧。此外,氧还参与了多酚化合物的氧化和聚合,从而形成沉淀,有利于成品啤酒的澄清。另一方面,氧分子得到啤酒中某些物质提供的一个电子之后形成超氧阴离子自由基(O-2),超氧阴离子自由基(O-2)再得到一个电子后形成过氧化物(O2−222-),O2−222-的pK值非常高,所以O2−222-形成后迅速形成过氧化氢(H2O2)。H2O2形成之后,在啤酒中Fe2+或Cu2+的催化下形成反应活性最强的羟基自由基(·OH),这三种自由基是已知啤酒中最重要的氧自由基。超氧阴离子自由基(O-2)在啤酒酿造过程中的自氧化和酶的催化氧化反应中也有生成,它具有比较强的生物毒性,少量的O-2便引起生物系统的破坏,还能导致酶的失活、酵母活性的下降、啤酒风味成分(脂肪酸、氨基酸、多酚和异α-酸等)的败坏、啤酒胶体稳定性的下降等,更重要的是能产生羟基自由基(·OH),羟基自由基(·OH)更具有反应活性和破坏力,更易与麦汁和啤酒中的氨基酸、酚类物质、不饱和脂肪酸、高级醇和异律草酮等发生氧化反应,使其氧化和降解,产生羰基化合物和挥发性醛类化合物。大量的实验证明,羰基类化合物是影响啤酒风味的最主要的物质,这些化合物也是造成啤酒老化的主要来源。既然无法避免氧的存在,那么可以从提高麦芽汁和啤酒的“内源性”抗氧化能力方面下手,从根本上消除或阻断氧自由基的形成,抑制或消除老化前体物质。于是既能清除O-2又能消除其它更具有破坏性的羟基自由基(·OH)根源的超氧化物歧化酶(SOD),便成为了啤酒生产过程中的研究重点。3在麦芽和母体内研究sod啤酒生产中SOD的主要来源两个方面,一是制麦时麦芽产生的;二是啤酒酵母自身携带的。3.1麦芽中sod的变化Bamforth报道了啤酒生产中相关SOD的研究,报道指出大麦中有三种SOD的同功酶,起主要作用的是Cu、Zn-SOD,分子量为31,000～33,000Da。在浸麦和发芽过程中,SOD的活性增加,发芽结束时绿麦芽中SOD的酶活是原来大麦的5倍左右。同时,Zielinski报道了油菜籽在发芽过程中SOD比活力呈上升趋势,发芽后的第六天达到最高水平,比未发芽的油菜籽的SOD比活力增加3倍左右,并且SOD比活力的变化与油菜籽中Cu、Mn的变化呈现显著的相关性,进一步间接的表明SOD是一种金属酶。在制麦过程中能显著增加的SOD,大量的残存与成品麦芽中,即使在焙焦结束时,麦芽中仍有50%左右的SOD酶活残存。大麦和麦芽中的SOD可以保护制麦阶段和糖化开始阶段由氧自由基引起的破坏,这有利于保留麦汁的还原力,提高麦汁的内源抗氧化力,从而提高啤酒的风味稳定性。3.2酵母合成sod的能力啤酒发酵时酵母的活细胞能利用胞内的SOD保护自身免受O-2的毒害,增加了细胞活性。发酵过程中酵母细胞内SOD的合成量呈先升高后降低的趋势,这与菌体的浓度和发酵液中氧的含量有很大的关系,发酵前期为好氧发酵,发酵液中的氧含量比较高,酵母的增殖速度较快,酵母合成SOD的能力亦随之上升;发酵后期为厌氧发酵,此时的氧分压极低,极大的限制了氧对酵母合成SOD的诱导,从而使SOD的合成量逐渐降低。Clarkson也指出,氧是酵母合成SOD的重要影响因素。4sed在啤酒生产中的研究和应用4.1浸渍时间对玉米萌发过程的影响在制麦阶段,添加赤霉素可有效的提高麦芽中SOD酶活的增长速度,但麦芽中SOD的合成总量影响并不大。于是,优化制麦工艺条件便成了提高麦芽中SOD活性的重点。对此,孟德敬通过Plackett-Burman实验,从浸麦温度、浸麦时间、发芽温度、浸麦水中、发芽时间、凋萎温度、干燥温度、焙焦温度8个变量中分析出3个显著因子:浸麦时间、发芽温度、焙焦温度。Eneje等人做了浸渍时间对玉米发芽特性的相关研究,指出合适的浸渍时间不仅有利于提高玉米的浸出率,而且更有利于发芽过程中酶系的形成。由此可见,要想使发芽的谷粒中获得较高的酶活,控制合适的浸麦时间显得尤为重要。另一方面,发芽温度和焙焦温度有明显的交互作用,当发芽温度和焙焦温度的编码在一定范围时,麦芽中SOD的活性大于2100U/g。因此,在工业上对麦芽中的SOD来说,控制合适的发芽温度和焙焦温度显的特别重要。同时从麦芽的库值、α-氨基氮、糖化力和β-葡聚糖含量看,普通制麦工艺下的麦芽与优化制麦工艺下的麦芽相比无明显的区别,说明优化后的制麦工艺对蛋白分解酶、淀粉分解酶和β-葡聚糖酶的活性没有明显的副作用。制麦结束后,由于焙焦过程使麦芽中SOD的酶活损失一半,但在成品麦芽的贮藏期间,SOD酶活却有明显的恢复,并且较高的贮藏温度有利于恢复的程度和速度,但是过高的贮藏温度会造成水解酶系的过度增长及虫害的发生,所以最适的温度为25℃。此外,在贮藏期间SOD能抑制脂肪酸的氧化,从而阻止了腐臭味异味的产生。Michelson和Monod已成功地发明了一项SOD延迟苹果汁、土豆和蘑菇腐败变质方面的专利。Bamforth报道了大豆中富有SOD,具有改善啤酒风味稳定性、延长啤酒保鲜期的潜力。4.2糖化过程中抗氧化能力的变化在糖化阶段,麦芽自身的SOD,作为活性氧自由基(O-2)的清除剂,理论上可有效地降低氧自由基的危害和减少糖化过程中内源性抗氧化物质的氧化。不同的麦芽制得的协定麦汁的还原力相差较大,这种变化可能原因是糖化过程中多酚类、类黑精以及硫醇类物质的复杂变化所引起,麦芽中SOD活性的差异可造成糖化过程(尤其是糖化初始阶段)保护这些还原性物质的程度不同,从而造成它们的氧化损失差异,最终体现在麦汁还原力的差别上。在糖化初始阶段有效保护麦汁中还原性物质,可以获得还原力较高的麦汁。而麦汁的还原力可作为一项重要的反映抗氧化能力强弱的指标,强的还原力一方面反映出麦汁具有较大的抗氧化能力;另一方面,还原力强的麦汁可以较好地减少煮沸时脂肪酸的氧化,减少反-2-壬烯醛的产生。另外研究表明,还原力高的麦汁啤酒的还原力较高,最终使得啤酒的风味稳定性好。在糖化过程中,SOD随着时间的延长,酶活力渐渐减弱,对麦汁的保护作用逐渐下降。当添加外源性SOD时,明显的抑制羰基化合物的生成,SOD可以有效地提高麦汁的内源性抗氧化力。随着糖化的进行,糖化温度不断升高,在65℃糖化15min后大部分SOD失活,30min后SOD几乎完全失活,此阶段又是氧自由基氧化风味物质产生风味老化物质的重要时期。因此,欲保护整个糖化的顺利进行,需在糖化时添加耐高温的SOD。Bamforth报道了大豆中的SOD,在72℃保温1h后有20%的SOD活性保留,91℃保温1h后仍有少量的SOD活性,可以在糖化全程保持麦汁的还原力、减少自由基对麦汁和啤酒质量的影响。4.3酵母细胞抗氧化酶系统在发酵阶段,向发酵液中添加外源性SOD有助于酵母细胞内SOD的合成。研究表明,发酵后期氧分压的降低会导致O-2的生成,O-2会对酵母菌产生危害,不仅引起酵母活力下降,而且还导致胞内氧化还原酶的合成能力下降。而添加外源性SOD可有效清除O-2,若同时添加过氧化氢酶(EC1.11.1.6,Catalase,CAT),SOD和CAT的协同作用不仅可清除O-2,而且还能阻断更具有破坏性和反应性的羟基自由基的形成,从而减少了活性氧对酵母的危害、保护酵母细胞的SOD合成能力。此外,向酵母液中添加外源性SOD也可以提高酵母细胞的增长速度以及酵母细胞自身的活力。由于外源性SOD的存在增加了酵母细胞的活力,使其增殖速度加快,降糖速度加快,对糖的利用率提高,所以外源性SOD可以提高发酵度。同时,由于SOD和CAT的协同作用有效地清除了发酵液中强氧化性的氧自由基,降低了发酵液中还原性成分(酚类物质、不饱和脂肪酸等)受氧自由基的破坏,从而更有效地保留了还原性物质,增加发酵液的还原力。在成品啤酒中,外源性SOD的加入明显减少了成品啤酒中的羰基化合物的含量,同时增加了成品啤酒的内源性抗氧化能力,可以显著地提高成品啤酒的风味稳定性。5现代化育种技术的应用目前已知,不管是内源性SOD还是外源性SOD,在啤酒生产的全程都具有重要的作用,同时,相应的问题也存在:首先,商品化的SOD成本较高,尤其是较高纯度的SOD更是昂贵,这使得外源性SOD在工业化生产上的应用受到很大的限制,因此,寻找更为经济实惠的SOD来源从而更好地实现其工业价值;其次,提高外源性SOD的酶活性及其特异性(例如耐热性),以便于使其在