中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白的工程化模型优化

中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白的工程化模型优化

近年来，许多科学家都担心葡萄糖钠的存在。主要原因是葡萄糖钠含有丰富的蛋白质和超过18种常见的氨基酸。其中，人体所需的氨基酸为8种。除了蛋氨酸含量较低外，其其他含量几乎与动物肌肉蛋白和牛乳蛋白相同。如果按照我国年产啤酒接近4000万吨计算,那么每年啤酒废酵母排放量约为40~60万吨,则被废弃掉的啤酒酵母蛋白约16~30万吨,由此可见,啤酒酵母蛋白资源浪费尤为严重。本文是在对啤酒酵母泥预处理方法、海藻糖与核酸等因子提取技术研究的基础上,借助对比分析和多元线性回归正交组合设计等试验方法,以啤酒酵母蛋白为底物,以中性蛋白酶的水解度为衡量指标,优化中性蛋白酶制备啤酒酵母功能性肽液或氨基酸产品的酶解方法,重点是优化中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白水解度达到40%以上的工程化数学模型,为深入研究核酸-核苷酸-氨基酸型的全方位全剂型产品奠定研究基础。由于啤酒酵母细胞壁的特殊细胞结构特征,所以本研究从蛋白酶解破坏细胞壁的角度看,可为深入研究从啤酒废酵母细胞中制备核酸及其衍生物、果糖二磷酸钠、谷胱苷肽、辅酶A和B族维生素等产品奠定研究基础,也可为解决啤酒生产企业环境污染问题和啤酒酵母蛋白优质蛋白资源综合开发利用提供一种技术路线。1材料和方法1.1白酶、l-酪氨酸平等氟、表面活性剂啤酒酵母蛋白由吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室提供;中性蛋白酶为天津泛氟国际贸易有限公司生产;L-酪氨酸(分析纯)购买于北京鼎国生物技术发展中心;浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、盐酸、碳酸钠、三氯乙酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等分析纯试剂均为北京化工厂生产。1.2仪器和检测方法AG204型METTLETOLEDO电子天平,瑞士生产;CR20BZ型高速离心机,HIMAG日立生产;ZD-2型自动电位滴定仪,上海雷磁有限公司生产;KDN-08C型数控定氮仪,上海精隆科学仪器有限公司生产;752型紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司生产;LGJ-50型冷冻干燥机,北京博医康技术公司生产;MILLIPORE牌超纯水机,美国生产;HH-S数显恒温水浴锅,常州市国立试验设备研究所生产。1.3蛋白质活力测定及水解度测定取一定量预处理后的干净酵母泥,配成4%酵母悬液,加入一定量的氯化钠于沸水浴中盐析5h后,迅速冷却于4℃、3600r/min离心10min,即得啤酒酵母蛋白。蛋白质含量测定采用GB2905-82方法;蛋白酶活力测定采用福林酚法;水解度测定采用PH-Stat法。水解度DH值的计算式为DH=V×1a×CMp×1htot(1)DΗ=V×1a×CΜp×1htot(1)式中:V为酶解所需NaOH质量,g;Mp为蛋白质总质量,g;C为NaOH浓度,mol/L;htot为每克蛋白质中肽键的克当量(取8.38);a为a-氨基酸的解离度。1.4试验计划1.4.1影响啤酒酵母蛋白水解度的因素以啤酒酵母蛋白水解度为衡量指标,通过对比分析啤酒酵母蛋白质量分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、中性蛋白酶的加酶量(2%、3%、4%、5%、6%、7%)、酶解温度(35、40、45、50、55℃)、酶解适宜pH(6.0、6.5、7.0、7.5)4个主要影响因素对啤酒酵母蛋白水解度的影响情况。1.4.2啤酒酵母蛋白最佳酶解参数的优化在单因素试验研究的基础上,借助多元线性回归正交组合设计方法,进一步优化啤酒酵母蛋白质量分数(Z1)、中性蛋白酶的质量分数(Z2)、酶解温度(Z3)、酶解适宜pH(Z4)4个主要因素,获得啤酒酵母蛋白最佳酶解参数,其试验设计因素编码表如表1所示。1.5交组合设计试验结果的统计分析利用SPSS13.0数据分析软件对多元线性回归正交组合设计试验结果进行数据分析,并对所获得的工程化回归模型进行回归系数的显著性检验、回归方程的显著性检验、偏回归系数检验三个重点方面的统计分析。2结果与分析2.1酶解时间对水解度的影响对比分析了6种啤酒酵母蛋白质量分数在中性蛋白酶[E]/[S]5%、pH6.5、酶解温度55℃、酶解时间为60min条件下对水解度的影响,如图1所示。啤酒酵母蛋白质量分数为1.5%试验组的水解度在60min酶解过程中一直处于最高水平。2.2不同因素对水解度的影响对比分析5种中性蛋白酶质量分数在啤酒酵母蛋白质量分数1.5%、pH6.5、酶解温度55℃、酶解时间60min的试验条件下对水解度的影响,如图2所示。由图可见,随着[E]/[S]的增大,水解度逐渐增大,当[E]/[S]为5.0%时,水解度达到最大。2.3温度对水解度的影响由于中性蛋白酶相对适宜温度范围为35~55℃,故考察其中5种温度水平在啤酒酵母蛋白质量分数为1.5%、中性蛋白酶质量分数为5%、pH6.5、酶解时间60min的试验条件下对水解度的影响,如图3所示。由图可见,水解度随着温度增加逐渐增大,55℃时水解度相对最高;随着酶解温度的升高,水解度变化趋势逐渐趋于平缓,因此,考虑到成本与能耗问题,55℃为相对理想水平。2.4ph对水解度的影响对比分析了中性蛋白酶4种pH值在啤酒酵母蛋白质量分数为1.5%、中性蛋白酶质量分数为5%、酶解温度为55℃、酶解时间为60min的试验条件下对水解度的影响,如图4所示。由图可知,当pH=6.0时,水解度达到最大值;随着pH值的提高,啤酒酵母蛋白的水解度均降低,主要是因为酶解酶只在一定的pH值条件下表现出最大的活力,高于或低于此pH时酶活力均降低,水解度最高水平是pH值为6.0。2.5多元线性回归方案和正交组合的设计方法和结果采用多元线性回归正交组合设计进一步优化啤酒酵母蛋白最佳酶解参数,其试验设计方案与11组实验结果如表2所示。2.6回归模型的构建及其评价2.6.1中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白的工程化回归模型采用SPSS13.0数据分析软件对多元线性回归正交组合设计试验结果进行数据分析,回归模型系数如表3中UnstandardizedCoefficients(B列)所示,中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白的工程化回归模型为yˆ=119.904+0.420Z1+1.575Z2+0.533Z3−20.384Z4y^=119.904+0.420Ζ1+1.575Ζ2+0.533Ζ3-20.384Ζ42.6.2回归模型的有效性(1)回归系数的有效性回归模型的系数显著性检验分析结果如表3所示。在4个预测变量中,仅有1个预测变量(酶解pH值)的显著性水平达到0.001。(2)蛋白水解度的回归模型回归的方程显著性检验分析结果如表4所示。方差分析表明,回归方程显著,F(4,6)=13.220,P=0.004<0.05,说明使用全部自变量来预测蛋白水解度的多重回归模型与数据拟和程度较好。(3)回归模型的建立对回归模型进行多重共线性的诊断分析结果如表5所示。由表可见,大部分特征根都非常小,接近0,证明预测变量相互之间存在高相关,意味着数据中的小变动会引起预测值的大变化。对回归模型的描述如表6所示。回归模型对蛋白水解度的预测效果比较好,多重相关系数R=0.948,多重测定系数R2=0.899,表明约有89.9%水解度变化可以用模型解释。2.7啤酒酵母蛋白工程化回归模型的确定利用西尔维斯特不等式可直接判别方程的极值,对中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白工程化回归模型进行求偏导解,优化出啤酒酵母蛋白质量分数为1.13%,中性蛋白酶质量分数为5.02%,酶解温度为54.3℃,pH值为6.1,验证3次试验技术参数,发现水解度均在44.71%以上。3蛋白水解度的预测和最佳工艺条件的确定(1)通过多元线性回归正交组合设计优化中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白的工程化回归模型为yˆ=119.904+0.420Z1+1.575Z2+0.533Z3−20.384Z4y^=119.904+0.420Ζ1+1.575Ζ2+0.533Ζ3-20.384Ζ4(2)通过对回归模型进行回归系数检验、回归方程显著性检验、偏回归系数检验可知,模型中Z4(酶解pH)系数显著性水平达到0.001;回归方程P=0.004<0.05,说明使用全部自变量来预测蛋白水解度的多重回归模型与数据拟和程度较好;多重相关系数R=0.948,多重测定系数R2=0.899,表明约有89.9%水解度变化可以用模型解释。(3)利用西尔维斯特不等式求偏导得到了酶解的最佳工艺条件:啤酒酵母蛋白质量分数为1.13%,中性蛋白酶质量分数为5.02%,酶解温度为54.3℃,酶解pH值为6.1时,经过3次验证发现水解度均在44.71%以上,达到了预期研究优化中性蛋白酶可控酶解啤酒酵母蛋白水解度达到40%以上