人发角蛋白-胶原海绵复合生物敷料的制备及对烧伤的促愈作用

人发角蛋白-胶原海绵复合生物敷料的制备及对烧伤的促愈作用

皮肤烧伤和伤口后，治疗的最终目标是重建或恢复皮肤屏障。在达到这个目标前,一个性能优良的创面敷料可以暂时替代皮肤的部分功能,提供一个有利于创面愈合的环境,等待创面上皮化或过渡到重建永久性皮肤屏障。因此,研制一种既可作为暂时性敷料用于浅度烧伤创面,以促进残存上皮再生,加速创面愈合,也可作为一种组织诱导材料,用于深度烧伤创面,重建真皮层的烧伤创面覆盖物,引起越来越多的重视。胶原海绵是由胶原蛋白制成的具有海绵状多孔结构的生物敷料,具有良好的止血性能、亲水及吸水性,且其粘附性好,可较长时间的用于创面覆盖。单纯胶原膜易干裂,且降解速率过快、机械强度小。有人将胶原与壳聚糖、透明质酸、纤维粘连蛋白等复合,可在一定程度上改善其性能,促愈合效果更明显。我们前期的研究发现,将人发角蛋白(HHK)与胶原海绵复合后制成的材料具有良好的组织相容性,胶原海绵在6周内可降解完全,而由Z(慢)、B(中)、F(快)三种组分的HHK编织成的网格在12周内可降解完全。虎杖甙(polydatin,PD)作为烧伤创面用药,具有促进结痂、抗感染等作用,能减少创面渗出,防止水分及电解质丢失,加快创面愈合,为用于Ⅱo烧伤较为理想的药物。聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)为合成的高分子聚合物,通过合成工艺控制有可能使其成为良好的药物缓释载体,可以包裹药物并保持膜的湿润,在较长时间内缓释药物。我们在对HHK的机制研究和临床应用中提出了一个全新的组织工程学概念—在体/原位组织工程。本研究在该理论的指导下,拟以HHK-胶原海绵为支架(植入体内),复合一种可作为药物(以PD为例)缓释载体的PHEMA(覆盖体表),探讨其在体内原位诱导周围组织细胞构建真皮的可行性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1体质量3g实验采用8~12周龄SPF级的雄性SD大鼠15只,体质量(380±20)g,购于南方医科大学实验动物中心。所有的大鼠均饲养在教研室专设的动物房内,基本设施齐全,环境清洁,通风、通气良好,门窗屏蔽性良好。1.1.2药物、生物、生物胃蛋白酶(1∶3000,北京鼎国生物技术公司),6-硫酸软骨素(Sigma公司),SDS(十二烷基硫酸钠)(上海生工生物工程公司),丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯(分析纯,广东光华化学厂有限公司),过氧化苯甲酰(化学纯,广东光华化学厂有限公司),虎杖甙(本校化学教研室提取并提供),Elastin(弹性蛋白)兔多克隆抗体、CollagenI(I型胶原蛋白)兔多克隆抗体、山羊抗兔IgG(武汉博士德生物公司),戊二醛猪皮生物敷料(威海华特生物品有限公司)。真空冷冻干燥机(ALPHA1-2LD,CHRIST),2001-UV紫外光谱检测仪(日本岛津),光学显微镜及照相系统(Olympus),扫描电镜(日立S-450)。1.2方法1.2.1hsk组成的制备用可控性的物理、化学处理方法制备具有轻(L)、中(M)、重(S)不同处理程度的三种HHK组分材料(由我校生化教研室肖应庆教授提供)。1.2.2水n-3-甲基-5-羟基苯基”的抽提将新鲜成年牛跟腱清洗,除尽残留脂肪和筋膜,再切成长(3.0±0.5)cm、厚(1.0±0.5)cm的条块,实验所用的原材料及器械均用洗必泰溶液(1:1000)浸泡10min消毒,再用0.9%医用生理盐水洗净材料表面的洗必泰。室温通风(23~27℃)迅速晾干牛腱表面的水分后置于-60℃低温冰箱中速冻,取出经切片(60μm)、称重后置于0.05mol/L乙酸溶液中(pH3.2),使胶原-乙酸的最终浓度为1.5%~2.5%(W/V),同时按1.5L抽提液(0.05mol/L乙酸)中含胃蛋白酶120mg的比例,加入胃蛋白酶并混匀,进行I型胶原蛋白的抽提。4℃冰箱中抽提48~72h(在此期间每隔4~5h搅拌),数小时后,原质韧的腱片开始膨胀,至膨胀成“棉絮状”。4℃条件下10000r/min离心30min,取上清,其上清液即为粗提的I型胶原蛋白。将上清在中性条件下进行盐沉淀,4℃条件下搅拌过夜。待沉淀完全后10000r/min低温离心30min,沉淀即为Ⅰ型胶原蛋白。将沉淀用冷灭菌蒸馏水作短时间洗涤后,溶解于0.05mol/L的乙酸中(使浓度为1.5%~2.5%,W/V),以相同浓度的乙酸作透析外液在4℃条件下透析48h,得精提的Ⅰ型胶原蛋白。短时存储于4℃箱备用(其性质用SDS电泳方法与标准品对照证实),然后与6-硫酸软骨素进行初次交联。1.2.3h药-胶原海绵复合膜的制备将S、M、L三种组分的丝状HHK以4:3:3的比例编织成网孔大小为1mm×1mm的网格状支架,与I型胶原蛋白一同置于模具内,经真空冷冻干燥后成膜,其过程即将纯的I型胶原蛋白,倒入自制的10cm×16cm玻璃模具内,震动铺平后,转入-20℃箱预冻4h以上,再转入-60℃低温冰箱内1h以上,然后快速移入真空冷冻干燥机,冷冻干燥60~72h后制成多孔膜。待样品温度回升至室温,置于电热恒温干燥箱内逐步加热至105℃,取出后室温下(23~26℃)恒温24h,即制成HHK-胶原海绵初交联膜。将HHK-胶原海绵复合膜置于0.25%戊二醛溶液中浸泡再交联。反复漂洗后干燥备用。1.2.4通过扫描电镜和海绵状结构的测定，确定了临江海绵的结构1.2.5紫外光谱测定以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯为甲基丙烯酸羟乙酯的反应物,以过氧化苯甲酰为引发剂,经回流、滴加等步骤完成甲基丙烯酸羟乙酯的聚合反应。将PD按一定比例溶于乙醇,与制备好的PHEMA载体充分混匀后成膜。取3cm×3cm大小的PHEMA/PD膜,浸于500ml37℃恒温的蒸馏水中,每隔一定时间(10min,20min,30min,1h,2h,4h,6h,8h……)从中取5ml浸提液用紫外光谱仪分析,其在波长为285.4nm处有最大吸收峰(由我校化学教研室完成)。根据Beer定律:A=εbc[A=吸光度,ε=mol吸光系数,b=光通过溶液的路程(设定为1cm],c=物质的摩尔浓度),可见A与c成正比。吸光度值越大,溶液中PD的含量越高。释药度经平行3次测定。1.2.6大鼠背侧壁深损伤动物模型的制备用盛有85℃的热水,底径为1.5cm的小烧杯,紧贴于脱毛后的大鼠背部皮肤15s,制备单个创面直径1.5cm的深Ⅱ°烧伤动物模型(经病理切片观察),以背部正中线为轴,每只大鼠左右各制作3个创面。1.2.7手术方法及术后随访创面制备后3d,对正中线一侧的3个创面行切痂、清洗消毒处理,同时分别覆以实验组(HHK-胶原海绵-PD/PHEMA复合生物敷料)、阳性对照组(戊二醛猪皮组)和阴性对照组(单纯无菌纱布组)的三种敷料(以后统称创面处理)。另一侧如法炮制。共对15只大鼠实施了手术操作。PD/PHEMA和无菌纱布隔日换药,观察创面肉芽组织生长情况。术后随机选取6只大鼠,作6周和8周取材用,以此为对象,每天观察并记录6只大鼠背部的创面愈合情况,以创面完全上皮化为标准,记录创面愈合时间;于第7、14、21天分别用透明胶片描记加称重法计算创面愈合率。于切痂覆敷料后1、2、4、6、8周,分别随机选取3只大鼠,切取整个创面及其周围组织,于光镜下行HE染色形态学观察、新生血管计数和胶原纤维及弹性纤维的免疫组织化学观察。1.2.8显示质量的测定以随机选取的作6周和8周取材用的大鼠为对象,分别于伤后第7、14和21天采用透明胶片描记加称重法(即首先将创面面积描绘在透明胶片上,再以此为模板,将质地均匀的透明胶片剪成同样大小,用分析天平称质量。以透明胶片质量间接地表示创面面积大小)测定局部创面面积,按下列公式计算:创面愈合率=[(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积]×100%。1.2.9视野及血管计数计数方法为:于第2周取材的组织切片(每组6张切片)上,每张切片在中央区及周边区各随机选取5个高倍(200倍)视野(0.25mm2),血管计数后求平均数。1.2.1预防宫腔形成过程中浚血压的比较新生血管数和愈合时间用均数±标准差表示,用完全随机设计资料的方差分析方法(SPSS11.0)比较3组的新生血管数和愈合时间,重复测量方差分析方法分析不同时间点的创面愈合率。以P<0.05为统计学差异显著水平。2结果2.1h药-胶原海绵膜的制备与标准品对照可见不同上样量的样品与标准品均在相同位置出现条带(图1)。两次交联后的HHK-胶原海绵膜0.1~0.2cm厚,质韧,有弹性,随形性好。扫描电镜观察:粗细不等的胶原纤维呈不规则立体多孔状结构,80%的孔径平均在150~200μm。2.3皮肤组织病理学观察SD大鼠背部烧伤后,创口边缘正常组织充血明显,创面轻度肿胀,无水泡,创面皮肤苍白无生机。伤后2~3d,创面坏死组织形成干硬的暗红色焦痂。2d后换敷料时,见实验组敷料均紧贴创面,湿度适宜。阳性对照组猪皮敷料仍呈灰白色,与创面贴附好,无浮动感。阴性对照组创面有少量渗血及渗液。2.4各组大鼠创伤后大鼠皮肤组织的变化烧伤后48h,大量组织变性坏死,表皮及毛囊上皮细胞肿胀或缺如,胞浆浓缩,核固缩,细胞界限不清,胶原纤维变性坏死,排列紊乱(图2、3)。创面处理后2周,各组创面肉芽组织灶形成,成纤维细胞增殖活跃,并分泌较细小的胶原纤维填充创面。实验组较阳性对照组更明显(图4),阴性对照组次之。新生组织中可见新生的毛细血管,实验组、阳性对照组较阴性对照组多(P=0.001,P=0.048)。实验组及阳性对照组在创面处理后4周均基本愈合,阴性对照组过半例数愈合。创面肉芽组织明显增厚。新生毛细血管增殖旺盛且管腔增大,阳性对照组更明显(图5~7)。8周后,3组创面均愈合良好。实验组及阳性对照组胶原纤维束改造塑形,无瘢痕形成趋势(图8)。阴性对照组愈合的表皮层细胞对合不好及真皮层组织排列紊乱(图9)。2.5免疫组织化学创面处理后2周,实验组创面真皮基质中I型胶原呈棕黄色细密条带状,且有少量被染成棕黄色细丝状的弹性纤维,阳性对照组不明显,而阴性对照组中弹性蛋白无阳性表达。第4周,实验组及阳性对照组均可见真皮基质中呈棕黄色粗大的条带或片状的I型胶原的强阳性表达。实验组弹性蛋白的阳性表达较2周时增加,且较阳性对照组明显(图10)。第6周,实验组及阳性对照组的I型胶原表达无明显变化,阴性对照组略有增加。弹性蛋白的免疫组织化学显示,阳性对照组的弹性蛋白表达较第4周更强(图11),阴性对照组中仅见散在表达,呈棕黄色丝状(图12)。第8周,胶原纤维束相互融合,免疫组织化学染色呈棕黄色均质状。弹性蛋白的免疫组织化学染色,实验组及阳性对照组仍可见少量被染成棕黄色的细丝状弹性纤维。2.6阴性对照组与阴性对照组的比较第2周,新生血管数的均值(个):实验组8.91±4.40个,阳性对照组6.18±3.41个,阴性对照组2.45±1.20个。实验组与阳性对照组创面的新生血管数差异无显著性(P=0.363),而实验组和阴性对照组的新生血管数差异有显著性(P=0.003),阳性对照组和阴性对照组新生血管数的差异也有显著性(P=0.022)。2.7实验组和阴性对照组的平均愈合时间比较3组平均愈合时间(d):实验组为20.625±1.164,阳性对照组为21.021±1.141,阴性对照组为28.104±1.014,可见实验组及阳性对照组的平均愈合时间明显早于阴性对照组。实验组与阳性对照组平均愈合时间的差异无显著性(P=0.387),而实验组和阴性对照组平均愈合时间的差异有显著性(P=0.000),阳性对照组和阴性对照组平均愈合时间的差异也有显著性(P=0.000)。2.8伤口愈合率实验组和阳性对照组在第7、14、21天的愈合率均较阴性对照组高,实验组仅在第14天时愈合率较阳性对照组高(表1)。3讨论3.1体调措施种子胞在体/原位组织工程是将可吸收生物支架材料植入体内,并通过材料本身对周围组织自身的种子细胞激活(或称成体干细胞)作用,利用体内微环境和体内精确的调节机制在体诱导分化和培养种子细胞,“在体/原位”构建相应的组织或器官,形成在解剖学、组织学和功能意义上的组织或器官替代物,从而克服了传统组织工程化组织或器官构建存在的问题。本实验即是以该理论为基础,探讨HHK-胶原海绵-PHEMA复合生物敷料“在体”诱导周围组织细胞构建真皮的可行性。3.2复合敷料对其缺失的新生血管的作用光镜下观察,我们大致可将此烧伤愈合过程分三阶段:静止期(0~1周),肉芽增生期(2~5周)和改建塑性期(6~8周)。静止期仍可见表皮细胞的胞浆浓缩,核固缩,胶原纤维变性坏死等。肉芽增生期创面可见明显的肉芽组织形成,成纤维细胞增殖活跃,并分泌、合成较细小的胶原纤维,新生组织中新生的毛细血管增多。改建塑形期创面均愈合,表皮细胞层渐增厚,胶原纤维束相互融合而粗大,排列规则紧密,皮肤附属器生成。有研究认为,创口周围表皮细胞增殖移行修复创面,一方面表皮细胞可促进成纤维细胞的增殖并减少其胶原的分泌,另一方面成纤维细胞通过旁分泌能促进表皮细胞的增殖,二者相互协调。我们在实验过程中也观察到,覆敷料后第2周,各组创面肉芽组织灶形成,成纤维细胞增殖活跃,分泌较细小的胶原纤维填充创面,且实验组及阳性对照组的新生组织中可见较多的新生血管。第4周,实验组与阳性对照组创面完全上皮化,肉芽组织增厚明显且新生血管管腔增大;阴性对照组过半数的创面完全上皮化。提示新生组织中的新生血管为增殖的表皮细胞提供充足的营养供应更有利于创面修复。处理后第6周,创面均愈合较好。实验组胶原纤维束相互融合,变得粗大且排列规则,而阳性对照组在靠近表皮层的胶原纤维束之间可见较多空隙,阴性对照组胶原纤维排列较紊乱;实验组与阳性对照组的真皮组织中均可见新生腺体,而阴性对照组第8周时愈合的表皮及真皮层细胞仍排列紊乱。从形态学结果分析:作为复合敷料的内层,HHK-胶原海绵主要是对烧伤愈合的第二个阶段—肉芽增生期起调控和促进作用,而对静止期和改建塑性期的创面影响相对较小。免疫组织化学染色观察:从第2周开始,实验组弹性蛋白的免疫组织化学染色阳性结果说明,HHK-胶原海绵-PHEMA/PD复合敷料有望改善烧伤后由于瘢痕增生、新生组织弹性功能差所致的外观差、功能障碍。敷料对I型胶原分泌及弹性纤维形成的促进作用,有利于加快创面愈合,缩短愈合时间,提高创面愈合率。通过第2周创面新生血管数的比较可见,实验组及阳性对照组的新生血管数均较阴性对照组多,说明两种敷料对创面愈合过程中的血管化均有促进作用。血管化作用对创面组织修复有重要意义,为新生组织、细胞提供养料,带走代谢废