高浓啤酒酿造过程中常见的问题

高浓啤酒酿造过程中常见的问题

酒果酸酶的过程是一种复杂的生化反应过程。在这一过程中，葡萄糖的释放环境不断变化，如碳源、氮源和溶氧消耗、溶血、乙醇浓度和温度的变化等。酵母细胞通过调控胞内的代谢情况能够快速的适应这些环境条件的变化,但是环境条件的变化超出了酵母细胞的适应范围,就会对酵母的生理活性产生诸多不利的影响。在高浓酿造(>15°P)过程中由于麦汁中高浓度可发酵性糖(麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖)的存在,发酵初期发酵液的渗透压较高,导致发酵后期乙醇浓度较高。这些环境压力都会给酵母细胞内的代谢反应带来不利的影响。自1970年代美国和加拿大等国将高浓酿造技术应用于啤酒生产工业中之后,国外学者就高浓酿造技术对酵母代谢的影响进行了大量研究,而国内的研究报道很少。这些研究主要集中在碳源物质(麦汁中可发酵性糖和储藏性糖等)的代谢、氮源物质(氨基酸和蛋白酶A等)的代谢、风味物质(酯类和高级醇类等)的代谢和能源物质(ATP、ADP和AMP等)的代谢等方面。目前,国内外已有多位学者对啤酒高浓酿造技术进行了较全面的综述,但针对酵母代谢情况的影响还缺乏系统的分析,而这些正是深入了解和把握高浓酿造技术的基础和出发点。1高浓度处理对葡萄酸钠水源的影响1.1麦汁对酵母降糖的影响在高浓酿造过程中,随着麦汁浓度升高,麦汁和发酵液的渗透压相应升高,乙醇产量也相应增加(见表1),渗透压升高使环境中的水对细胞的可给性降低,形成一定程度的生理干燥,并且乙醇浓度过高对酵母也产生一定的毒害作用,因此酵母生理活性降低,降糖速率也随之降低,使发酵周期延长。Suihko等研究了发酵温度为10℃时,不同浓度麦汁对酵母降糖的影响,当表观发酵度达到80%时,12、16、20°P和23°P麦汁的发酵周期分别为5、6、9d和14d,麦汁浓度增加使发酵周期延长。进一步分析发现(图1),在发酵的前4天,麦汁浓度升高对酵母降糖的影响并不显著,继续发酵,乙醇浓度和渗透压进一步升高,酵母的生理活性降低,降糖速率变慢,麦汁浓度越高,在发酵后期对酵母降糖的影响越大,从而使发酵周期延长。1.2麦芽糖代谢活性的变化在工业化生产中,有很多企业使用糖浆来提高麦汁浓度进行高浓酿造,研究表明,糖浆中糖组分之间比例的改变,可能会导致高浓麦汁中糖组分的较大波动,因此这个比例对酿酒酵母利用糖类物质具有重要影响。Rautio等研究发现,在高葡萄糖麦汁(100g麦芽糖/L和55g葡萄糖/L,麦芽糖∶葡萄糖=1.8∶1)中,发酵前20h,Ale和Lager酵母菌的麦芽糖转运酶活性受到显著的抑制。提高麦芽糖和葡萄糖比例(120g麦芽糖/L和25g葡萄糖/L,麦芽糖∶葡糖糖=4.8∶1),在24°P高浓麦汁中,麦芽糖代谢基因(MALx1,MALx2和MTT1)在葡萄糖浓度大于20g/L时表达率开始增加,同时麦芽糖转运酶活性也相应增加,说明葡萄糖未对麦芽糖代谢产生抑制作用。当发酵50h时,麦芽糖和麦芽三糖的浓度分别为90g/L和35g/L,但麦芽糖代谢基因的表达量已迅速降低为最大表达率的20%,这可能是由于在高麦芽糖浓度的麦汁中,组蛋白甲基化对麦芽糖代谢基因产生了强烈的抑制作用。由此可知,高浓酿造麦汁的麦芽糖和葡萄糖的比例过高或过低都对酵母利用糖类物质产生不利的影响,因此确定合适的麦芽糖和葡萄糖比例及其酵母代谢机理是今后研究的重要方向。1.3麦汁浓度对lager酵母菌糖原和海藻糖浓度的影响酵母糖原是由D-葡萄糖聚合而成的支链聚合物,经过磷酸化和水解后,以葡萄糖单元被酵母吸收利用,胞内海藻糖是一种由D-葡萄糖组成的非还原性二糖,其发酵速度比胞外糖还快。糖原和海藻糖是酵母细胞内重要的碳水化合物,它们的最大含量约占细胞干重的1/4,是酵母细胞的重要储能物质,也是酵母细胞耐受极端环境(高渗透压、高酒精浓度和低溶氧)的重要指标。酵母细胞内糖原和海藻糖浓度随麦汁浓度升高而升高。在正常浓度的麦汁(12°P)中,Lager酵母菌中的海藻糖浓度较低,是干细胞的1.5%,当麦汁浓度升高到18°P时,胞内海藻糖浓度增加到细胞干重的14%。Lies等筛选得到高浓酿造优良酵母菌GT336,在23°P高浓麦汁中其胞内糖原和海藻糖浓度比出发菌株CMBS33显著降低,有效的增加了乙醇的转化率。1.4麦汁对酵母细胞活性的影响酵母将麦汁中的可发酵性糖转化生成乙醇,随着麦汁浓度的增加乙醇浓度也随之升高,但浓度过高(>24°P)麦汁发酵不完全,最终的乙醇浓度反而降低(表2)。由表2知,麦汁浓度在22-24°P时,与其他浓度的麦汁相比乙醇的最终浓度、最大生成速率和比生成率都较大,说明麦汁在此浓度范围内有利于乙醇的生成,但乙醇浓度过高又会对酵母细胞产生毒害作用,细胞活性随着乙醇浓度升高而降低。原因是由于高浓度的乙醇通过对细胞膜产生作用,细胞膜的透性和构造便发生变化,结果引起细胞膜对H+的通透性增加,使H+大量进入细胞,降低了细胞内外的离子浓度梯度,并使细胞质的pH值下降,从而导致细胞的生理状态发生变化,活性降低。2高浓度栽培对母氮代谢的影响2.1酵母细胞的代谢活力在啤酒酿造过程中,啤酒酵母的胞外蛋白酶活力很弱,麦汁中蛋白质很难被降解利用,酵母繁殖所需要的氮源主要依靠吸收麦汁中的游离氨基酸(FAN)。在高浓麦汁中FAN浓度影响酵母的酒精耐受性和酒精生产速率,添加FAN可以提高最终的酒精浓度和细胞产量。Michael研究发现,向高浓麦汁中添加甘氨酸也可以促进酵母的生长和发酵,当甘氨酸浓度逐渐增加到0.04mol/L时,促进效果最佳,添加赖氨酸可以缩短发酵周期,促进酵母代谢活力,增加酵母细胞量。精氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是合成酵母细胞的主要氨基酸,其中异亮氨酸和缬氨酸还是啤酒风味物质(双乙酰、乙偶姻和2,3-戊二酮)的重要前体。Lies等检测了在23°P高浓麦汁中酵母细胞的精氨酸和异亮氨酸、缬氨酸合成基因ARG1和LEU1的表达率,结果发现在高浓条件下这2个基因的表达率降低了2-6倍。这说明高浓环境抑制了酵母细胞自身合成这些氨基酸的能力,使酵母只能从麦汁中获得这些氨基酸,因此在高浓酿造过程中适当的提高麦汁中这些氨基酸的含量有利于酵母细胞和风味物质的生成。2.2高浓酿造过程中疏水多肽含量的变化高浓酿造与低浓酿造的啤酒相比泡持性要差,在相同的主酵和后酵条件下,对18°P和12°P的全麦麦汁进行发酵,最后均将乙醇稀释成体积分数为5%,测定啤酒泡持性(HRV)发现高浓酿造的HRV比低浓酿造低了10%。Cooper等研究发现,在高浓酿造(20°P)过程中疏水多肽含量的降低比低浓酿造(10°P)显著,而疏水多肽含量与HRV直接相关,高浓酿造开始时发酵液中疏水多肽含量约为200mg/L,发酵结束时约为50mg/L,降低了75%,低浓酿造开始时疏水多肽含量约为140mg/L,到发酵时约为95%,仅降低了32%。在高浓酿造过程中,随着发酵的进行,营养物质缺乏,乙醇浓度和渗透压升高会引起酵母细胞不正常的分泌胞外物质,蛋白酶A酶原就在此时大量的分泌到胞外,当酶原遇到适宜的条件,如pH4.0-4.5的发酵液或啤酒时可以转化成具有活性的蛋白酶A,蛋白酶A将疏水多肽降解,使啤酒泡沫稳定性降低。在高浓酿造过程中,随着发酵的进行,蛋白酶A活性逐渐升高,并且在整个发酵过程中,高浓酿造发酵液中蛋白酶A的活性均比低浓酿造高2倍以上。3高浓酿酒中的酯类物质高浓酿造对啤酒风味物质的形成具有重要影响,Saerens等对比了高浓酿造(16°P)和低浓酿造(12°P)对风味物质形成的影响(表3)。结果发现,麦汁浓度升高对高级醇类和邻酮类物质影响并不显著,对酯类物质影响较为显著,尤其是乙酸乙酯。高浓酿造啤酒的酯类含量相对较高,所以更容易产生异常的香气和口味,因此控制高浓酿造啤酒中的酯类物质含量是保证啤酒品质重要的一环。Stewart等认为高浓麦汁中可发酵性糖的组成是酯类物质含量增高的主要原因,研究发现含质量浓度为30%的麦芽糖浆(葡萄糖和果糖的含量较高)的20°P麦汁与含30%的高麦芽糖浆(麦芽糖和麦芽三糖的含量较高,葡萄糖和果糖的含量较低)的20°P麦汁相比,后者产生的乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量约降低了25%。因此,提高高浓麦汁中麦芽糖的含量,将有利于控制酯类物质的增加。酵母在含较高麦芽糖的麦汁中比在含较高葡萄糖和果糖的麦汁中生成较少的酯类物质可能有2个原因,一是发酵麦芽糖生成乙酰CoA水平较低,二可能是麦芽糖的传递会影响酵母细胞内pH,pH的变化将影响酯酶或酰基转移酶的活性,从而影响酯的生成。4酵母细胞的生理状态细胞通过水解三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)生成磷酸腺苷(AMP)释放自由能,自由能的释放与胞内各种合成反应和耗能过程紧密相关。在高浓酿造过程中,细胞膜对H+的通透性随着乙醇浓度增加而增加,胞内H+积累,使细胞质pH发生变化,因此为了使细胞质中pH值接近正常pH值(约为6.4),需要消耗大量的ATP将H+泵出细胞。ATP水解生成较高浓度的AMP或较高的ADP∶ATP能够显著的抑制酒精过量生成,维持酵母细胞的正常生理状态。Pedro等的研究也证实了这一点,酵母在25°P麦汁中发酵,胞外的AMP浓度(3μmol/L)高于在15°P麦汁中发酵的AMP浓度(1μmol/L)。对于细胞的代谢反应,ATP、ADP和AMP浓度的比值关系,即能荷(EC)比ATP的绝对浓度更重要,EC值的变化保持在0-1。EC=[ATP]+0.5[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]EC=[AΤΡ]+0.5[ADΡ][AΤΡ]+[ADΡ]+[AΜΡ]Hysert等认为EC值的变化可以用来指导啤酒的酿造。目前,对这种指导作用的机理的研究还存在着不同的观点。Dombek等研究发现,在高浓酿造过程中,乙醇比生产速率变化与EC值的变化是一致的,当细胞进入稳定期后,乙醇比生成速率降低,EC值也随之降低,从0.7降到0.1,但是Pedro等对25°P麦汁进行发酵,认为EC值的变化与α-葡萄糖苷的吸收利用存在一定关系,在发酵液中酵母细胞对α-葡萄糖苷的吸收速率迅速降低时,EC值和细胞活性也迅速下降。5保证优良高浓酿造工艺的根本理论依据目前,有关啤酒高浓酿造的研究报道非常多,但绝大部分都是研究高浓酿造对酵母发酵性状(耗糖、生物量和乙醇产量等)和酵母本身(大小、活性等)的影响,对酵母胞内代谢情况影响的研究却较少,而这些正是保证选育优良高浓酿造酵母菌和优化高浓酿造工艺的根本理论依据。虽然现在国外就高浓酿造对酵母代谢的影响做了一些工