产苯乳酸乳酸菌的筛选与鉴定

产苯乳酸乳酸菌的筛选与鉴定

随着人们生活水平的提高和健康意识的提高，人们对食品的质量有了更高的要求。除了食品的营养、感觉和包装外，食品的安全性也值得关注。由于食品的特殊性,其防腐保鲜一直是研究的重要方面。长期以来,由于受到经济环境和开发水平的制约,几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期。化学防腐剂如果超剂量使用会产生累积毒性和致癌作用,存在局限性。因此,具有安全、广谱、高效及经济实用的天然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。苯乳酸(phenyllacticacid,PLA),也称3-苯基乳酸,是近年来发现的一种新型天然防腐剂,具有良好的抑菌性,能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,且安全性能高、水溶性好、热稳定,在食品工业中具有较好的应用前景。苯乳酸可由多种微生物产生,如霉菌中的白地霉,细菌中的丙酸菌和乳酸菌,其中乳酸菌因其悠久的应用历史和广泛的应用范围在食品工业中占有特殊的地位,因此乳酸菌来源的苯乳酸成为研究热点。笔者采用双层平板法从传统发酵制品中分离,筛选出1株产苯乳酸的乳酸菌,并进行了鉴定,以期为进一步育种研究奠定基础。1材料和方法1.1试验材料1.1.1采样发酵制品购自锦州大润发超市。1.1.2指的是细菌啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。1.1.3ph值调ph改良TJA培养基:酵母粉5g/L,牛肉膏10g/L,乳糖20g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氢二钾2g/L,乙酸钠5g/L,吐温-801ml,番茄汁50ml。调pH值至6.2～6.4。初筛培养基:改良TJA培养基中添加质量分数为2.5%CaCO3,0.5%的山梨酸钾(抑制真菌生长),1.5%的琼脂。液体发酵培养基:蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,牛肉膏10g/L,葡萄糖20g/L,K2HPO32g/L,NaCO30.4g/L,MgSO40.5g/L,FeSO40.01g/L。调pH值至6.2～6.4。指示菌培养基:麦芽浸膏20g/L,蛋白胨1g/L,葡萄糖20g/L,琼脂粉15g/L。调pH值至5.4。1.1.4主要试剂苯乳酸购自ALFA公司,其他材料为市售。其中,甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。1.1.5主要设备和设备日立高效液相色谱系统:配有日立L-7420紫外检测器和Kromasil-C18反向色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。1.2方法1.2.1过滤方法(1)单菌落的筛选在无菌操作台将发酵制品捣碎倒入三角瓶中加20ml无菌水充分振荡,取10ml接种于初筛培养基中30℃培养24h,采用常规平板稀释法,挑选有碳酸钙溶解圈的单菌落并镜鉴。将革兰氏阳性,接触酶阴性的菌体接种到斜面培养基上30℃培养24h,放入冰箱保存。(2)培养基制备采用双层平板拮抗法筛选,下层培养基为固体改良TJA,受试菌再下层培养基划线,长度为2cm左右,置于生化培养箱中30℃培养48h后倾注10ml上层指示菌培养基,将指示菌配成浓度为106CFU/ml菌悬液于上层培养基涂布。30℃培养48h,观察抑菌情况。1.2.2乙醇萃取制备工艺将经过筛选获得的菌株接种液体发酵培养基,30℃培养48h。取10ml发酵液,加20ml乙醇,5000r/min离心15min,取上清液,95℃水浴40min,分别用10ml乙醚萃取2次,合并2次萃取液,50℃挥干,用甲醇溶解定容至10ml,冰箱冷藏备用。1.2.3n的变化情况HPLC条件:流动相为甲醇和水的混合液,梯度洗脱程序:0～15min由70%甲醇线性变化至100%,15～20min保持100%甲醇,20～22min由100%甲醇线性变化至70%。检测波长:210nm,流速为1ml/min,柱温为30℃,进样量为10μl。1.3识别菌株1.3.1观察蘑菇的形态将获得的高产菌株接种于改良TJA固体培养基上,30℃培养48h,观察菌落形态,并进行革兰氏颜色,荚膜染色,于光学显微镜下观察。1.3.2对蘑菇的生理生化评价按照《伯杰细菌鉴定手册》进行菌株的生理生化特性鉴定。1.3.3srd核酸序列分析(1)16SrDNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,将测定的16SrDNA序列在NCBI核酸数据库进行BLAST搜索,与数据库中已有的16SrDNA序列进行相似性比较分析。(2)从GenBank中选择近缘菌株的16SrDNA基因序列,应用MEGA4.1软件进行ClustalW多重比对,采用Neighbour-joining方法构建系统发育树,并进行bootstrap分析,重复次数为1000次。2结果与分析2.1发酵培养中苯乳酸含量检测以啤酒酵母为指示菌,经过双层培养基法从初筛得到的115株乳酸菌分离株中筛选出24株对啤酒酵母有明显抑制效果的菌株,结果见表1。将菌株接种于液体发酵培养基发酵,30℃静置培养48h后检测发酵液中苯乳酸含量。结果发现24株菌均产苯乳酸,其中有7株菌的苯乳酸产量>60mg/L。乳酸菌菌株P421显示出最高的苯乳酸生产能力,在液体发酵培养基中30℃培养48h,苯乳酸产量可达80.5mg/L,菌株P421的发酵液HPLC图谱见图1,其对啤酒酵母的拮抗作用见图2。2.2高产菌株的识别2.2.1织物的变化,菌株P421在改良TJA培养基上生长菌落光滑,湿润,乳白色;显微镜观察表明,菌体形态为杆状,单独、成对或短链排列,革兰氏染色呈阳性,无荚膜,无芽孢,不形成孢子。2.2.2植物乳杆菌的鉴定根据常规生理生化鉴定,结果见表2,参照《伯杰细菌鉴定手册》,初步判定P421为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。2.2.3srdna分析测序结果表明该菌株的16SrDNA序列共1527bp,将序列提交GenBank数据库,得到登录号为GQ360031,在GenBank数据库中与已有的16SrDNA序列进行相似性比较分析,从中选择近缘菌株的16SrDNA基因序列,应用MEGA4.1软件构建系统进化树。由图3可知,P421与L.plantarumWCFS1和L.plantarumEW-p位于同一簇群,1000次bootstrap分析完全支持该分枝,同源性达100%,与乳酸菌的其他种的发育关系相对较远。根据P421的形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,将菌株P421鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),并命名为LactobacillusplantarumP421。L.plantarumP421在系统发育地位上属于Bacteria、Firmicutes、Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae