干细胞联合番茄红素对d-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用

干细胞联合番茄红素对d-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用

治疗小细胞老老过程中,建议把联合抗衰老结合起来,把带共体干部的输注后于细胞治疗的背景中检查出背景细胞内的细胞a1.树干和番茄红素的抗衰老已成为医学研究的热点。根据之前两种方法，试验将异体源酪氨酸基因移植到异体酪氨酸酶诱导的老鼠体内。同时，对于相关的老化指标进行了检测，并将其与单独的树干和番茄红素治疗进行了比较。观察移植细胞的分布和安全性。旨在探讨干细胞、番茄红素二者联合抗衰老的作用,为抗衰老研究提供一种新的模式-联合抗衰老。2对于干细胞、番茄红素二者联合抗衰老的研究,国内外研究甚少,实验弥补了该空白,同时为脐带间充质干细胞的深入研究及其应用奠定了基础。3由于时间、资金问题,实验未对干细胞在体内的分化做进一步研究,课题组会在后续的实验中深入探讨。0间充质干细胞衰老(agingorsenescence)是复杂的自然现象,涉及诸多领域,表现为机体结构和功能衰退,适应性和抵抗力降低。有关衰老的机制,学者们曾提出许多学说。立足于衰老发生的自由基机制,目前研究表明,间充质干细胞和清除自由基的抗氧化剂番茄红素均可表现出不同程度的延缓衰老作用。间充质干细胞是来源于中胚层的一种多能干细胞,最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能、造血支持和免疫调控等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下可分化为多种组织细胞,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。来源不同的间充质干细胞其生物学特性非常相似。脐带间充质干细胞相对于骨髓间充质干细胞具有无肿瘤污染、增殖能力强、采集方便、免疫活性低、无需配型等许多优点,并且脐带作为医疗废弃物,对供者无不利影响,不受伦理问题的限制,使得脐带间充质干细胞极有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。番茄红素属于类胡萝卜素的一种,主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中,是目前自然界中发现的功能最强的抗氧化剂之一,通过猝灭单线态氧和清除自由基,防止脂蛋白和DNA受到氧化破坏,从而抵抗衰老并预防癌症的发生。目前,干细胞抗衰老、番茄红素抗衰老研究已成为医学研究的热点前沿,但以往的研究几乎都是各自单独的抗衰老研究,对于二者联合抗衰老作用,国内外研究甚少,目前基本处于空白状态。文章在以往2种方法单独研究的基础上,用异体来源脐带间充质干细胞移植到D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠体内,同时给予番茄红素灌胃,通过检测相关衰老指标,与单独的干细胞、单独的番茄红素治疗相比较,并观察植入细胞在衰老小鼠体内的分布及安全性。旨在探讨二者联合抗衰老的作用,为抗衰老研究提供一种新的模式——联合抗衰老,同时为脐带间充质干细胞的深入研究及其应用奠定基础。1材料和方法随机对照动物实验。于2012年3至10月在中国科学院中药研究所完成。实验动物及设备8周龄ICR小鼠80只,SPF级,体质量25-35g,雌雄各半,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2012-0001,动物饲养环境为SPF级,实验过程中对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。由北京大学航天临床医学院中心实验室提供。主要试剂和仪器连接到辐射干燥物和番茄红素的抗衰老试验中体外细胞中cm-dii表达及组织学检测将80只ICR小鼠适应性饲养1周后,分性别按体质量随机分为对照组、模型组、干细胞治疗组、番茄红素治疗组、干细胞联合番茄红素治疗组,每组16只,雌雄各8只。除对照组外其余4组每天颈背部皮下注射5%D-半乳糖,给药量为500mg/kg,连续8周;对照组则给予相同体积生理盐水。动物每周称1次体质量,根据体质量变化调整给药量。造模同时,以葵花籽油为溶剂溶解番茄红素,给小鼠灌胃,连续8周。给药量按照人的等效剂量(0.5mg/kg)给药5.5mg/kg,对照组和模型组灌以等量葵花籽油。动物每周称1次体质量,根据体质量变化调整给药量。CM-DiI溶于DMSO中制成1g/L保存液。将保存液稀释到生理盐水中制成浓度为1mg/L工作液。25mm3培养瓶培养贴壁细胞至80%融合去培养基,PBS洗涤两三遍,加入上述CM-DiI工作液4mL;然后37℃孵育5min+4℃15min,PBS洗涤2遍,然后胰酶消化细胞,锥虫蓝计数后,PBS洗涤2遍,加入DMEM/F12培养基,调整细胞浓度为1×1010L-1。造模第1周末,干细胞治疗组、干细胞联合番茄红素组经小鼠尾静脉输注经CM-DiI标记的第2-4代人脐带间充质干细胞悬液0.2mL/只,细胞浓度为1×1010L-1,以后每2周1次,共4次。其余组则于尾静脉给予等量细胞培养液。解剖前将小鼠背部剃毛,于末次给药12h后称质量并摘取眼球,取血1.5mL放入EP管中,以3500r/min离心15min,分离血清,置于-80℃冰箱冻存待测。取血后将其断头,迅速取出肝脏、全脑、肺脏、肾脏、皮肤分别用预冷的4℃生理盐水冲洗表面残血,滤纸吸干水分,将肝脏左叶、大脑左半球、全部皮肤组织样品放于15mL离心管内于-80℃冰箱保存;取肝脏右叶、大脑右半球、全部肾脏、全部肺脏迅速置于液氮中。取各组小鼠血清、脑匀浆、肝脏匀浆、皮肤匀浆测定:①超氧化物歧化酶活性检测:采用WST-1法测定,按照试剂盒说明进行,酶标仪450nm波长处测定。②丙二醛含量检测:采用硫代巴比妥酸法,按照试剂盒说明进行,半自动生化仪532nm波长处测定。③羟脯氨酸含量检测:组织样本酸水解法,按照试剂盒说明进行,半自动生化仪550nm处测定。取对照组、模型组、干细胞治疗组、干细胞联合番茄红素组小鼠大脑、肝脏、肺脏、肾脏组织行连续冰冻切片,片厚10µm,经苏木精-伊红染色后于光学显微镜下观察各组织是否发生病理形态学改变。取对照组、模型组、干细胞治疗组、干细胞联合番茄红素组小鼠大脑、肝脏、肺脏、肾脏组织制成冰冻切片,用含DAPI的抗淬灭剂封固,3min后荧光显微镜下观察CM-DiI标记细胞在主要组织器官的分布情况。小鼠血清、大脑和肝脏组织中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及皮肤中羟脯氨酸含量;小鼠大脑、肝脏、肺脏、肾脏组织形态学变化;人脐带间充质干细胞在主要组织器官的分布情况。所得数据均以ue0af±s表示,采用SPSS18.0软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析,P≤0.05为差异有显著性意义。2d-半乳糖后色泽纤维80只ICR小鼠随机分为5组,全部进入结果分析,中途无脱失。与对照组相比,模型组小鼠皮下注射D-半乳糖4周后,逐渐出现毛色暗淡,少有光泽,动作迟缓,反应不灵敏等衰老征象,且随给药时间延长,表现愈加明显。3个治疗组小鼠一般情况介于模型组和对照组之间,且干细胞联合番茄红素组小鼠的毛色、光泽、反应灵敏度等情况优于干细胞治疗组,干细胞治疗组优于番茄红素治疗组。2.3个治疗组与模型组超氧化物歧化酶活性的比较表1模型组小鼠超氧化物歧化酶活性明显低于对照组,组间比较差异有非常显著性意义(P≤0.01),显示出机体抗氧化能力下降,氧自由基增多。在血清中,干细胞、番茄红素、干细胞联合番茄红素治疗可以显著改善衰老小鼠的抗氧化能力,提高超氧化物歧化酶活性,与模型组之间的差异有显著性意义(P=0.040,0.045,0.000),同时联合组将超氧化物歧化酶活性提高至对照组小鼠水平。在肝脏中,3个治疗组超氧化物歧化酶活性与模型组相比差异有显著性意义(P=0.022,0.037,0.000)。在大脑中,3个治疗组超氧化物歧化酶活性与模型组相比差异有显著性意义(P=0.021,0.036,0.000)。同时干细胞联合番茄红素治疗可将超氧化物歧化酶活性提高至对照组小鼠水平。干细胞治疗组、番茄红素治疗组与干细胞联合番茄红素治疗组相比,超氧化物歧化酶活性较低,且差异有显著性意义(P<0.05)。2.4小鼠体内丙二醛、羟脯氨酸、mda的组织形态变化模型组丙二醛含量明显高于对照组,组间比较差异有非常显著性意义(P≤0.01),显示出机体脂质过氧化产物增多。在血清中,干细胞、番茄红素、干细胞联合番茄红素治疗可以显著改善衰老小鼠脂质过氧化产物增多的状况,降低丙二醛含量水平,与模型组之间的差异有显著性意义(P=0.024,0.042,0.000),同时联合组可将丙二醛含量降至对照组小鼠水平。在肝脏中,3个治疗组丙二醛含量与模型组相比差异具有显著性意义(P=0.030,0.029,0.000)。在大脑中,干细胞、干细胞联合番茄红素组丙二醛含量与模型组相比差异有显著性意义(P=0.016,0.000)。同时联合组可将丙二醛含量降至对照组小鼠水平,而番茄红素治疗组与模型组比较差异无显著性意义(P=0.057)。干细胞治疗组、番茄红素治疗组与干细胞联合番茄红素治疗组相比丙二醛含量较高,且差异有显著性意义(P<0.05)。模型组小鼠皮肤中的羟脯氨酸含量明显低于对照组,组间比较差异有显著性意义(P≤0.01),干细胞、番茄红素、干细胞联合番茄红素治疗可以显著提高衰老小鼠皮肤中羟脯氨酸含量,延缓皮肤衰老,与模型组之间的差异有显著性意义(P=0.034,0.037,0.000),而且干细胞联合番茄红素治疗可将皮肤中羟脯氨酸含量提高到对照组小鼠水平。干细胞治疗组、番茄红素治疗组与干细胞联合番茄红素治疗组相比羟脯氨酸含量较低,且差异有显著性意义(P<0.05),见图3。人脐带间充质干细胞移植后第8周的组织病理切片显示,干细胞治疗组、干细胞联合番茄红素治疗组小鼠各组织结构清晰,均未发生坏死、明显纤维化,未见肿瘤组织形成。与对照组及模型组比较,人脐带间充质干细胞移植后各组织形态无明显异常改变,见图4。对小鼠大脑、肺脏、肝脏、肾脏组织组织进行大量连续冰冻切片,荧光显微镜下可见CM-DiI标记的细胞大量分布在大脑、肺脏,在肝脏、肾脏中也有分布,但较前两者少,见图5。对照组及模型组中均未见红色荧光背景干扰。3胞外因子与细胞抗氧化作用文章在建立D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型的基础上,用脐带间充质干细胞和番茄红素进行干预。结果表明,经D-半乳糖注射后小鼠体内超氧化物歧化酶活性、皮肤羟脯氨酸含量明显下降,丙二醛含量明显上升,目前认为D-半乳糖引起的代谢紊乱使机体过氧化反应增强是其致老化反应的重要因素。给动物连续注射D-半乳糖后,D-半乳糖在体内氧化产生的大量自由基超过机体的清除能力,引发脂质过氧化的链式反应,产生大量的脂质过氧化物丙二醛,加重对细胞的损伤,并伴随着抗氧化酶超氧化物歧化酶的减少以及反映皮肤弹性的羟脯氨酸含量的降低。所以作者这次实验采取D-半乳糖致亚急性衰老模型,并检测机体中超氧化物歧化酶、羟脯氨酸、丙二醛的含量用以评价衰老模型制作是否成功。实验结果确认了D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠模型的建立,从而也为后续实验结果和理论分析的成立提供了保证。比较模型组与治疗组超氧化物歧化酶活性、羟脯氨酸及丙二醛含量发现,输入脐带间充质干细胞后,小鼠体内超氧化物歧化酶活性、羟脯氨酸含量较模型组均明显上升,而丙二醛含量则明显下降,说明脐带间充质干细胞抗衰老作用显著;经番茄红素灌胃后,小鼠体内超氧化物歧化酶活性、羟脯氨酸含量均较模型组明显上升,血清、肝脏中丙二醛含量则明显下降,说明番茄红素具有一定的抗衰老作用;经干细胞联合番茄红素治疗后,小鼠体内超氧化物歧化酶活性、羟脯氨酸含量较模型组显著提高,丙二醛含量显著降低,其血清、大脑中的超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及皮肤中的羟脯氨酸含量较对照组差异不显著,说明干细胞联合番茄红素治疗在一定程度上可使D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠恢复至正常水平。3个治疗组相比,干细胞联合番茄红素组小鼠体内超氧化物歧化酶活性、羟脯氨酸含量较单独的干细胞、番茄红素治疗均明显上升,而丙二醛含量则明显下降,说明干细胞联合番茄红素治疗作用优于二者单独治疗。本实验证实,番茄红素在血清、肝脏中的抗氧化作用尤其是对抗丙二醛的生成效果较大脑中明显,似乎与其在体内的吸收、分布有关。因番茄红素主要存在人的血液、肾上腺、肝脏、睾丸、前列腺、乳腺、卵巢、子宫、消化道等器官中,其中血液、肾上腺、睾丸、肝脏等器官中含量较高,且吸收的番茄红素主要储存在肝脏中,而其他组织中含量较低。但干细胞联合番茄红素治疗在大脑中的效果却优于在肝脏中的效果。通过CM-DiI荧光示踪,发现脐带间充质干细胞输入到衰老小鼠体内后,脑中含量最高,其次是肺、肾、肝,此点似乎与血流量和组织结构有关。由此作者推断,在两者联合抗衰老中脐带间充质干细胞起主要作用。移植后的组织病理切片显示,各组织结构清晰,均未发生明显坏死、纤维化,这表明将脐带间充质干细胞经尾静脉输注到衰老小鼠体内是非常安全的。D-半乳糖能引起生物体内及细胞内自由基活性的改变及氧化应激损伤,是导致动物亚急性衰老及干细胞衰老的共同机制。脐带间充质干细胞能够归巢于损伤组,并且具有移植后不发生免疫反应的特点。作者推测脐带间充质干细胞在此过程中的作用机制可能有以下几个方面:组织损伤修复,即脐带间充质干细胞进入体内之后能够激活小鼠体内处于休眠状态的干细胞,参与已经受到过氧化和代谢累积损伤的组织和器官的修复作用,干预自由基应激损伤使其恢复正常功能;分泌营养因子,促进损伤组织内细胞增殖分化,恢复组织器官生理功能;免疫功能调节,有研究发现间充质干细胞在体外和体内试验中能够通过分泌可溶性因子和直接接触调节免疫细胞增殖及其活性,降低机体的炎性反应病变;调节代谢功能,间充质干细胞通过其多向分化能力,增强代谢系统效率,进而加速机体对代谢废物的运转和排泄,促进对营养物质的吸收,使机体维持正常的生理功能,从而降低因D-半乳糖造成的有害废物的积累,干预亚急性衰老。但这些作用应与间充质干细胞的归巢及其与组织细胞相互作用有关,其详细机制尚待进一步的研究。综上所述,作者认为脐带间充质干细胞联合番茄红素较二