红曲红素型广东客家娘酒的研制

红曲红素型广东客家娘酒的研制

广东客家酒是黄酒的一个重要分支。黄酒是中国最古老的酒种之一。享有“国家葡萄酒”的美誉，被称为世界三大发酵酒。黄酒含多种氨基酸、肽类、矿物质等营养物质,发热量高,易被人体消化吸收,被誉为“液体蛋糕”。客家娘酒是以糯米为主要原料,经红曲霉与其他微生物共同发酵而成的低度酿制酒。红曲霉菌能产生多种对人体有益的初级、次级代谢产物。1979年,日本学者远藤章从红色红曲霉菌(Monascusruer)培养物中发现了降固醇活性物质MonacolinK(lovastatin)且食用后未发现急、慢性中毒现象,也无致突变作用。近几年来,专家学者们对红曲色素、GABA等红曲代谢产物也进行了深入研究,发现其具抑菌防腐、保鲜,抗氧化,抗肿瘤,抗疲劳,降低血脂、血压,抗炎症,抗突变,增强免疫力,抗抑郁症,预防动脉硬化等多种生理活性。将产MonacolinK红曲霉菌应用于客家娘酒生产中,采用单因素正交试验对广东客家娘酒进行优化,得到一种功能性客家娘酒曲种优化条件,对提高娘酒中功能性成分及生产功能性客家娘酒具有一定的理论意义和现实意义。1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器红曲菌种:WH-1、WH-2(广东五华红曲厂);SH(福建古田县生华有限公司);LF(福建绿峰红曲有限公司);ZJ(广东河源紫金酒厂);GT-1、GT-2(福建古田红曲厂);FG(广东梅州峰山国红曲有限公司);ZS-1、ZS-2(浙江三禾生物科技有限公司);JN-1、JN-2(江西诺博生物科技有限公司);白糯米(海珠区兴安超市);米酒(广东石湾酒厂有限公司);甜酒药、麦曲(广东河源紫金酒厂)。试剂:硫酸铜(CuSO4·5H2O);亚甲基蓝;酒石酸钾钠;亚铁氰化钾[K4FeCN6];无水葡萄糖、无水乙醇、氢氧化钠等均为分析纯;甲醇(色谱纯);洛伐他丁(标品,Sigma公司)。仪器设备:高效液相色谱仪1100:AgilentTechnologies;ZORBAXEclipsePlusC18柱4.6×250mm,5μm:AgilentTechnologies;紫外分光光度计DU730;可控温超声波清洗器KQ5200;电子精密天平BS223S;微量高速离心机TG16-W;数显恒温水浴锅HH-2;立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-30KBS;生化培养箱SPX-150;手持糖度计;酸度计等。1.2实验方法1.2.1lg1lg1催化淀粉6d活性单位的选择以廉爱农法测定还原糖含量,酶活性单位为1min催化淀粉产生lmg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个活力单位(U/g)。1.2.2吸光度测定用70%vol乙醇溶液溶解0.2000g红曲(40~60目)样品,并将其转入100mL容量瓶中,取一定量稀释液于10mm比色皿中,以70%vol乙醇溶液做参比,在波长510nm和410nm下测定其试样浸泡稀释液的红曲黄与红曲红的吸光度A。式中:X——试样的色价,U/g;A——浸泡稀释液的吸光度;m——称取样品的质量,g。V——吸取乙醇浸泡液的体积,mL。1.2.3测波长和流速利用HPLC法对MonacolinK进行测定,色谱条件为甲醇/0.1%磷酸水溶液=75∶25;检测波长238nm;柱温33℃;流速1.00mL/min。对两种形式的MonacolinK进行标准曲线的绘制(见表1)以及加标回收率、重现性试验,在加标回收率试验中平均加标回收率已达73.43%,重现性试验中相对标准偏差为0.729%~0.892%,说明该方法具有较高的准确度及精密度。1.2.4传统妇酒配方参照一般广东客家娘酒酿制工艺(传统娘酒配料:糯米100g,红曲5g,麦曲0.7g,酒药0.7g),工艺流程见图1。1.2.5甜型妇酒感官评分参考黄酒国家标准(GB/T13662—2000)制定甜型娘酒感官评分方法,对黄酒的色泽(A)、香气(B)、滋味(C)和风格(D)4个因素,以很好、较好、一般、较差和差所代表的不同分值进行评价,记录结果。1.2.6正交试验试验分别对麦曲用量、酒药用量、红曲用量以及红曲的配比进行单因素酿酒试验,以MonacolinK含量、感官评价及酒精度为评价指标,选出3个影响娘酒感官评价的因素进行L9(34)的正交及对照试验。2结果与分析2.1细菌筛选2.1.1各菌株糖化力的检测红曲中含多种酶类,将其应用于酿制娘酒,能够将原料中的淀粉和脂肪分解,在酵母协同作用下,生成有机酸、醇和酚等代谢产物,从而使娘酒具有独特的风味。糖化力高低直接关系到娘酒的质量和产量,因此,在实验中筛选出糖化力高的红曲作为特征性红曲,对各菌株的糖化力进行分析,结果见图2。从图2可知,FG曲中糖化活力是其他曲种的2~1000倍,确定糖化力高的曲种为红曲FG。2.1.2特征性红曲的筛选红曲色素是通过红曲霉生长代谢产生的一种聚酮体混合物,具多种生物活性,在娘酒酿制过程中易溶入酒体,使酒体不但具娘酒独特色泽,同时还具有红曲色素所独有的功效。诸多数据表明,红曲色素的测定以测定红曲红素与红曲黄素为主,在实验中拟筛选出色价高的红曲作为特征性红曲。图3为不同红曲的色价测定结果。从图3可知,WH-1色价最高。因此,选择WH-1作为特征红曲。2.1.3红外曲子检测红曲中MonacolinK含量对于制备含MonacolinK的娘酒至关重要。实验中对12种红曲曲种进行了MonacolinK含量的测定,结果见表2。从表2可知,仅4个红曲曲种被检测到MonacolinK。综合红曲糖化力和成本等因素考虑,本实验并未选择MonacolinK含量最高的曲种,而是选择红曲ZS-1作为特征性红曲。根据Endo教授的研究:每天服用0.01~0.05mg的MonacolinK可使胆固醇含量明显降低,假设每人每天摄入10mL以ZS-1曲种酿制的娘酒能达到降低胆固醇功效,根据酿酒实验得ZS-1红曲添加量为1g/100g糯米(以下试验菌种的加入量均以每100g糯米换算)。2.2优化测试2.2.1曲种对妇酒酒品的影响在检测各红曲曲种糖化酶活力、红曲色素、MonacolinK含量的基础上,以传统的客家娘酒生产工艺,改变红曲(FG/WH-1)配比(0∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶0)、红曲(FG/WH-1)的加入量(3g、4g、5g、6g、7g)、麦曲的加入量(0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g)、酒药的加入量(0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g)进行酿酒试验,研究曲种对娘酒酒品的影响。各单因素最优水平及其试验指标测定结果见表3。分析各单因素的试验结果,对照传统客家娘酒曲种复配条件,考察四因素对娘酒发酵过程的作用及影响,红曲的添加量基本确定为ZS-11g,其余红曲5g,考虑到产品品质及生产成本不再进行优化。选择红曲FG/WH-1配比,麦曲及酒药的量进行正交试验。2.2.2曲种配比及含量对总氧精度和酒精度的影响根据上述单因素的分析结果对红曲FG/WH-1配比(1∶2、1∶1、2∶1)、麦曲(0.6g、0.7g、0.8g)及酒药(0.6g、0.7g、0.8g)的量为3因素,以MonacolinK含量、感官、酒精度为评价指标,进行L9(33)正交试验,结果见表4。对上述结果进行了极差分析发现,在含MonacolinK红曲加入量一定的条件下,酒药的加入量对总MonacolinK含量、酒精度和感官评价均有较大影响,主要是因为酒药微生物以酵母为主。酵母发酵产生酒精,MonacolinK属于醇溶性物质,同时醇类物质又是酒的骨架成分之一。依据表4正交结果可知,曲种配比及含量为A1B1C1(FG/WH-1为1/2,麦曲0.6g,酒药0.6g)时,MonacolinK含量、酒精度和感官评价均为最好。为迎合现代人对酒品的要求,在保证一定的MonacolinK含量及娘酒特色的前提下,结合生产实践需要,确定各因素水平最优配比为A1B1C1。2.2.3关于“观念类”me为验证正交所得结果的可靠性与准确性,以此水平进行重复性试验及对照试验,选择正交最优水平(A1B1C1)和单因素中最优菌种复配(A3B2C2),与传统客家娘酒进行对照。各指标见表5。从表5可知,采用A1B1C1工艺条件,无论在MonacolinK含量、感官评价,还是其他指标均优于传统娘酒酒样与A3B2C2,且总糖、总酸相对比较适宜,赋予A1B1C1娘酒清醇柔和、细腻鲜爽的风味特征。同时,在重复性试验中酿制娘酒的MonacolinK含量为3.560mg/L,酒精度为18.2%vol,与正交结果基本一致,且保持稳定,说明配料比是合适的,可满足生产需要。3复配条件确定广东客家娘酒以红曲为特色曲种,红曲的加入使得客家娘酒具备很多功能。但其种类繁多,功能倾向不同,做出来的娘酒的品质也各异。通过对不同厂家的12种红曲中MonacolinK含量、糖化酶活力、红曲色素进行分析,选出3种特征性红曲:红曲ZS-1MonacolinK含量为13.410mg/g,糖化酶活力为112.972U/g;红曲FG糖化酶活力为1011.192U/g;红曲WH-1中红曲红色价1220U/g,红曲黄1165U/g。通过单因素试验与正交试验确定了酿酒的最佳曲种复配条件:糯米10