川半夏资源亲缘关系的sds-webg分析

川半夏资源亲缘关系的sds-webg分析

蛋白质分子受遗传因素控制，通常存在于植物细胞中，反映了生物dna组成的差异。其中，可溶性蛋白质在植物发育过程中具有强烈的异质性和相对稳定性。因此被广泛应用于植物的遗传标记、植物品种鉴定、品种间的遗传变异以及遗传多样性分析。半夏为天南星科多年生草本植物,历版《中国药典》收载的半夏为Pinelliaternata(Thunb).Breit.,其以干燥块茎入药,性温、味辛、有毒,是一种重要的中药材。近年来,因部分地区药用习惯,各地至少有同科3属11种植物充作半夏使用,如水半夏、掌叶半夏、狗爪半夏等。半夏作为川产道地药材,资源分布十分广泛,但其形态变异(叶形变异、珠芽变异、块茎变异)等问题一直未能有效解决。而目前对川半夏的研究,主要集中在成分分析方面。对川半夏可溶蛋白的研究仅有王双明对绵阳本地半夏的15份材料作了亲缘关系的初步探讨。为此,本研究收集了16份川产半夏与9份其他产区的野生半夏,进行了可溶蛋白的遗传多样性分析,旨在探讨川半夏资源的遗传差异,为其分类鉴定以及资源保护利用等提供了一定参考依据。1briet材料供试材料见表1。经四川农业大学杨光辉教授鉴定供试材料包括23份半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit材料,2份掌叶半夏PinelliapedatisectaScotte材料。于2007-08引种在四川农业大学教学科研实验站,2008年春每份材料分别选择直径1cm左右的块茎种植在相同地块,每份材料种植2行,同一份材料各单株间农艺性状表现基本一致。2方法2.1sds-溴化反应2008-12每份材料取大小基本一致的块茎称重,按1mg加2.5μl的冰水,研钵中匀浆,转移至2ml离心管中冰浴浸提2h,使用前12000r/min,离心5min,取上清液50μl加入等体积样品缓冲液(0.5gSDS,1ml2-Me,5ml甘油,0.5mg溴酚蓝,500μlTris-HClpH6.8定容至25ml)混匀,100℃水浴5min,放冷至室温,置4℃冰箱中备用。除样品缓冲液中甘油含量减半外,叶片处理方法与块茎相同。2.2氨基酸衍生物的诱导诱导酶活性检测采用不连续分离系统,分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为4%。电泳中所用的低分子量标准蛋白(14.3～97.2KD)购自宝生物工程(大连)有限公司,包括六种标准蛋白:磷酸酶b(97.2KD)、牛血清蛋白(66.4KD)、卵清蛋白(44.3KD)、碳酸苷酶(29.0KD)、胰蛋白酶抑制剂(20.1KD)、溶菌酶(14.3KD),在试验中作为半夏可溶蛋白条带对照。电泳仪为Bio-Rad公司的PROTEAN®ⅡXiell型电泳槽。电泳条件为指示剂在浓缩胶时,电流为20mA,当指示剂进入分离胶时,电流调为25mA,在常温下进行,电泳时间为前沿指示剂溴酚蓝刚好迁移至板底时立即停止电泳。电泳结束,每块胶用300ml染色液(0.3g考马斯亮蓝R-250、135ml甲醇、30ml冰醋酸和135ml水定容至300ml)染色过夜,染色毕,将凝胶板用蒸馏水漂洗数次,然后加入脱色液(37.5ml冰醋酸,25ml甲醇加水至500ml)反复脱色,至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止。拍照,统计。随机抽取5份材料,重复试验以检验其电泳条带是否一致。2.3ss聚类分析按条带的有无对每份材料进行统计,条带存在时赋值为1,否则赋值为0。按Nei的方法计算材料间的遗传相似系数GS,遗传距离GD=1-GS。GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Ni为i号材料出现的条带数,Nj为j号材料出现的条带数,Nij为i号材料和j号材料共有的条带数。利用GS值按不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行遗传相似性聚类分析。统计分析在NTSYSpc2.1系统下进行。3结果3.1电泳图谱带表面活性剂压所有供试材料在同一条件下进行电泳,图1为供试材料叶片可溶蛋白电泳图谱,图2为供试材料块茎可溶蛋白电泳图谱。各重复间的电泳图谱,除个别极弱谱带(未用于统计)外均表现一致。试验结果表明,所有供试材料可溶蛋白电泳图谱表现出一定的遗传变异,表现在各材料间的电泳图谱带型上具有数量、位置和染色深浅不同的带纹。而经SDS分离的可溶性蛋白谱带中叶片的带数比块茎的丰富。叶片共分离出19条迁移率不同的带纹,3条带纹为所有材料共有,每份材料可分离出8～18条比较清晰的带,平均13.5条。块茎共分离出了12条迁移率不同的带纹,3条带纹为所有材料共有,每份材料可分离出5～12条比较清晰的带,平均9.6条。3.2川夏各材料间的遗传相似系数gs所有半夏材料叶片可溶蛋白平均GS值为0.786,变异范围为0.333～1.000,而2份掌叶半夏遗传相似系数GS值0.933,半夏与掌叶半夏遗传相似系数GS平均值0.687。川半夏与其他省半夏材料间遗传相似系数GS平均值0.693。所有材料叶片可溶蛋白S07-14与S07-27遗传相似程度最低,GS值仅为0.333,说明它们之间的遗传差异最大。块茎可溶蛋白中,所有半夏材料内遗传相似系数变幅为0.500～1.000,平均值0.738,而2份掌叶半夏遗传相似系数GS值为0.857,半夏与掌叶半夏遗传相似系数GS平均值0.678。川半夏与其他省半夏材料间遗传相似系数GS平均值0.703。所有材料块茎可溶蛋白遗传差异最大的两份材料是S07-20与S07-3,GS值为0.500。3.3可溶性蛋白及掌叶织物对25份供试材料间的可溶蛋白遗传相似系数按UPGMA法进行聚类分析(图3～4)。从聚类图可以看出,无论是块茎还是叶片,其可溶蛋白在GS值为0.817水平上所有材料都可以聚为五大类。叶片可溶蛋白第Ⅰ类包括来自四川、江苏、贵州、河南、云南、安徽六省共17份材料,第Ⅱ类包括四川雅安的两份材料及都江堰、宜宾共4份材料,河南内乡夏关的1份三叶半夏单独为第Ⅲ类,四川阆中的1份栽培品种与四川江油的1份材料聚为第Ⅳ类,第Ⅴ类仅有1份来自山东荣城的材料。两份掌叶半夏均聚在第Ⅰ类。块茎可溶蛋白第Ⅰ类聚有17份材料,分别来自四川、江苏、贵州、河南、山东、安徽六省,第Ⅱ类由河南的1份五叶狭叶半夏与四川广元1份材料,四川南充的2份材料聚为一类,第Ⅲ类由都江堰和雅安周公山的2份材料组成,2份虎掌半夏聚为第Ⅳ类,云南的1份材料构成第Ⅴ类。4讨论4.1加快叶片的诱导酶系统和可溶性蛋白的电泳谱带分析李丽、郭巧生等研究表明,半夏种内不同居群同工酶存在明显的遗传差异。谢中稳根据对7个半夏居群成熟叶片与块茎的2个酶系统和可溶蛋白的电泳谱带分析,认为半夏是一个遗传多态性物种。本研究对25份半夏资源的叶片和块茎进行了可溶性蛋白图谱分析,分别分离19种和12种不同的带纹中都仅有3条带纹为所有材料共有,表明半夏资源的遗传多样性丰富。4.2半细胞染色体核型植物的繁殖方式决定了基因在代间的传递情况,影响到居群的遗传结构。半夏繁殖方式复杂:以珠芽或子块茎进行营养繁殖为主,兼有有性繁殖和无融合生殖,正是这种以无性繁殖为主的繁殖方式,才使各地遗传变异在独立的环境中被保存下来,半夏繁殖方式的特殊性使得半夏细胞染色体数目复杂多变,存在复合多倍体以及非整倍性,本研究的25份材料就包括2n=26,54,78,84,88,91,101,104,117在内的9种不同数目的染色体数,其中16份川半夏就有8种不同数目的染色体数(另文发表),聚类分析结果表明,染色体数目相同或相近的材料有聚在一起的趋势,但也有少数例外,且这种趋势在叶片可溶蛋白中的反应比块茎可溶蛋白中明显。如叶片可溶蛋白中染色体数目为2n=88的三份材料SO7-10、SO7-31和SO7-01在GS=0.912水平上聚类在一起。4.3川夏各品种间的遗传相似性程度的对比Barker等认为遗传距离的信息应作为决策保种计划时群体结构和品种分化最基本的指标。遗传距离是研究物种遗传多样性的基础,一般认为群体分化时间越短,遗传距离越小,遗传相似性越大。对比16份川半夏、7份省外产区半夏与掌叶半夏的GS值后发现,川半夏种内的GS值高于川半夏与省外产区的GS值,说明川半夏之间遗传相似程度相对比川半夏与其他省的半夏材料间的相似程度大,是相对比较独特的地方宗。本试验结果还表明,川半夏种内的GS值高于川半夏与掌叶半夏间的GS值,即种间遗传差异大于种内遗传差异。从叶片电泳图谱也可以看出,几乎所有半夏材料颜色最深、最宽的带纹,在掌叶半夏中并未出现。进一步说明了二者确实存在真实的遗传差异,部分地区采用虎掌半夏替代半夏用药需慎重。通过对聚类结果进行分析,发现不同叶型的半夏材料并不能单独聚类。如来自河南的五叶狭叶半夏,尽管形态比较特殊,但