大熊猫重要疾病检测技术规范

大熊猫重要疾病检测技术规范范围本标准规定了大熊猫重要传染性疾病及寄生虫病的病原检测项目、病原检测方法、病原检测规则、结果判定和检测结论、废弃物处理等内容和要求；本标准适用于XX省大熊猫转运、健康监测、野外救护等病原检测方案。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T18646-2018动物布X氏菌诊断技术SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范DB51/T1710.4-2013大熊猫检疫技术-犬冠状病毒实验室检测技术规范-RT-PCR方法DB51/T1710.5-2013大熊猫检疫技术-肠侵袭性大肠杆菌（EIEC.0152）的实验室检测技术规范DB51/T1710.7-2013大熊猫检疫技术-犬腺病毒实验室检测技术规范-PCR方法DB51/T1710.9-2013大熊猫检疫技术-蜱实验室检测技术规范DB51/T1710.10-2013大熊猫检疫技术-蠕形螨实验室检测技术规范DB51/T1710.14-2013大熊猫检疫技术-肺炎克雷伯氏杆菌的实验室检测技术规范DB51/T1710.16-2013大熊猫检疫技术-金黄色葡萄球菌的实验室检测技术规范DB51/T1710.18-2016大熊猫检疫技术-乙型脑炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法DB51/T2387-2017大熊猫检疫技术-弓形虫检疫技术规范DB51/T2389-2017大熊猫检疫技术-隐孢子虫检测技术规程术语与定义下列术语和定义适用于本标准。聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction，PCR用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。反转录ReverseTranscription，RT是DNA生物合成的一种特殊方式，以RNA为模板，通过反转录酶合成DNA。互补脱氧核糖核酸ComplementaryDNA，cDNA以信使核糖核酸为模板，在反转录酶作用下进行反转录所得到的脱氧核糖核酸。病原微生物PathogenicMicroorganism指可以侵犯机体，引起感染的微生物。病原微生物指朊毒体、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。寄生虫Parasite指具有致病性的低等真核生物，为在宿主或寄主体内或附着于体外以获取维持其生存、发育或者繁殖所需的营养或者庇护的一切生物。主要仪器低温冰箱。生物安全柜。超净工作台。涡旋振荡器。可调微量加样枪。高速离心机。PCR仪。电泳仪。凝胶成像系统。恒温培养箱。恒温摇床。生物显微镜。水浴锅。高压灭菌锅。病原检测项目病原微生物必须检测项目犬瘟热病毒CanineDistemperVirus猫泛白细胞减少症病毒FelinePanleukopeniaVirus轮状病毒Rotavirus金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus侵袭性大肠杆菌Enterinvasive

E.coli布氏杆菌Brucella必要时补充检测项目犬腺病毒CanineAdenovirus犬冠状病毒CanineCoronavirus乙型脑炎病毒EncephalitisBVirus肺炎克雷伯菌KlebsiellaPneumoniae寄生虫必须检测项目巴贝斯虫Babesia西氏贝蛔虫Baylisascarisschroederi蜱虫Ixodidae必要时补充检测项目隐孢子虫Cryptosporidium蠕形螨Demodex弓形虫Toxoplasmagondii病原检测方法病原微生物犬瘟热病毒，检测核酸，方法见附录A；轮状病毒，检测核酸，方法见附录B；猫泛白细胞减少症病毒，检测核酸，方法见附录C；犬腺病毒，检测核酸，方法见DB51/T1710.7-2013；犬冠状病毒，检测核酸，方法见DB51/T1710.4-2013；乙型脑炎病毒，检测核酸，方法见DB51/T1710.18-2016；金黄色葡萄球菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.16-2013；侵袭性大肠杆菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.5-2013；布氏杆菌，检测抗体，方法见GB/T18646-2018；肺炎克雷伯菌，检测核酸和病原菌，方法见DB51/T1710.14-2013；寄生虫巴贝斯虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录D；西氏贝蛔虫，检测核酸和显微镜观察，方法见附录E；隐孢子虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB51/T2389-2017；蜱虫，显微镜观察，方法见DB51/T1710.9-2013；蠕形螨，显微镜观察，方法见DB51/T1710.10-2013；弓形虫，检测核酸和显微镜观察，方法见DB51/T2387-2017。病原检测规则7.1采样方式样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008《出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范》执行。按照病原检测（病毒、细菌、寄生虫）所需样品要求联合取样。在行为训练条件下非麻醉或者麻醉状态下采集大熊猫的粪便、肛拭子、口咽拭子、鼻拭子、血液、毛发或皮屑、乳汁或胸腹水等样本。7.2送检要求样品和样品送检单需尽快送达实验室，如实、详细填写样品送检单上的动物信息（个体谱系号或呼名）、样品名称、采样日期、数量、检测项目等内容。如不能立即送检，则样品需根据不同的检测项目选择相应的保存方式。检测病原核酸的样本应保存在-20℃或-80℃冰箱内，细菌培养和寄生虫镜检样品需4℃保存，在48h内送检。结果判定及结论根据使用的试剂及方法说明，进行结果判断；未见阳性结果，判断为阴性结果；出现阳性或可疑结果时，应在使用一个疗程药物治疗或间隔2个潜伏期后进行二次检测，二次检测结果为阳性或可疑结果时判定为阳性。根据检测结果出具检测报告，检测报告应包括动物信息、样本信息、检测方法、检测结果和结论。废弃物处理废弃物处理按照GB/T19489-2008《实验室生物安全通用要求》7.19执行。

（规范性附录）

大熊猫犬瘟热病毒反转录RT-PCR检测方法A.1样品采集与处理样本为大熊猫的口咽拭子或新鲜粪便，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008《出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范》执行。A.2待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA，反转录为cDNA。反转录体系见表A.1。表A.1犬瘟热病毒的反转录体系组分加入体积（μL）总RNA28AMVBuffer1010MmdNTP7RandomPrimer（N9/N6）1Oligod（T）Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50室温孵育10min，42℃水浴1~1.5h。A.3RT-PCR反应引物参照地方标准引物上游引物（5’-3’）：CGAGTCTTTGAGATAGGGTT下游引物（5’-3’）：CCTCCAAAGGGTTCCCATGAA.4对照设立阳性对照：取已知犬瘟热病毒阳性cDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。A.5RT-PCR反应体系及条件A.5.1RT-PCR反应体系见表A.2。表A.2犬瘟热病毒的RT-PCR反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5总体系25A.5.2RT-PCR反应条件95℃预变性3min后循环开始，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃最后延伸7min。A.5.3RT-PCR扩增产物大小产物大小：454bp。A.5.4RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%X脂糖凝胶电泳检测（120V，30min），通过凝胶成像系统观察结果。A.6结果判定阳性对照出现454bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现454bp目的片段时，判定犬瘟热病毒阳性；未出现454bp目的片段时，判定犬瘟热病毒阴性。

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大熊猫轮状病毒反转录RT-PCR检测方法B.1样品采集与处理样本为大熊猫的肛拭子或新鲜粪便样品，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008《出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范》执行。B.2待测样品RNA提取及反转录将样品按照病毒RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA，反转录为cDNA。反转录体系见表B.1。表B.1轮状病毒的反转录体系组分加入体积（μL）总RNA28AMVBuffer1010MmdNTP7RandomPrimer（N9/N6）1Oligod（T）Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50反应程序：37℃45min，85℃5s，4℃保存。B.3RT-PCR反应引物上游引物（5’-3’）：TGGTATTGAATATACCACAAT下游引物（5’-3’）：AAGGATGGCCCACAGGATCAGB.4对照设立阳性对照：取已知轮状病毒阳性质粒cDNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。B.5RT-PCR反应体系及条件B.5.1RT-PCR反应体系见表B.2。表B.2轮状病毒的PCR反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5总体系25B.5.2RT-PCR反应条件95℃预变性5min后循环开始，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃最后延伸10min。B.5.3RT-PCR扩增产物大小产物大小：340bp。B.5.4RT-PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%X脂糖凝胶电泳检测（120V，30min），通过凝胶成像系统观察结果。B.6结果判定阳性对照出现340bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阳性；未出现340bp目的片段时，判定轮状病毒阴性。

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大熊猫猫泛白细胞减少症病毒巢式PCR检测方法C.1样品采集与处理样本为大熊猫的肛拭子和粪便样品，采集后立即送至实验室进行病原检测。样品的采集、运输和保存按照SN/T2123-2008《出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范》执行。C.2待测样品DNA提取及反转录将样品按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA。C.3巢式PCR反应引物C.3.1NS1巢式PCR反应引物根据NS1基因序列设计外套：上游引物（5’-3’）：CATGGACCAGCAAGTACAGG下游引物（5’-3’）：CAGTGCAAGGTCCACTACGT内套：上游引物（5’-3’）：AGCTGGTAACTTTGGTCAAC下游引物（5’-3’）：GGATTGTTTGCCGCTTGTGTC.3.2VP1巢式PCR反应引物根据VP1基因序列设计外：上游引物（5’-3’）：GAACACGACGAAGCTTACGC下游引物（5’-3’）：AGCTGCTGGAGTAAATGGCA内：上游引物（5’-3’）：TTCTCGCCAGCAGATCAACG下游引物（5’-3’）：CTCCCCAAGCATTTGCATCAC.4对照设立阳性对照：取已知猫泛白细胞减少症病毒疫苗DNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。C.5PCR反应体系及条件C.5.1PCR反应体系NS1基因外套反应体系见表C.1。表C.1NS1基因外套反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1ddH2O8总体系20NS1基因内套反应体系见表C.2。表C.2NS1基因内套反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.8下游引物0.8DNA模板0.4ddH2O18总体系30VP1基因外套反应体系见表C.3。表C.3VP1基因外套反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1ddH2O8总体系20VP1基因内套反应体系见表C.4。表C.4VP1基因内套反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix12上游引物0.8下游引物0.8DNA模板0.5ddH2O15.9总体系30C.5.2PCR反应条件NS1基因外套：95℃预变性5min后循环开始，95℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸50s，共31个循环，72℃最后延伸5min。NS1基因内套：95℃预变性5min后循环开始，95℃变性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸40s，共31个循环，72℃最后延伸5min。VP1基因外套：95℃预变性5min后循环开始，95℃变性30s，55.5℃退火40s，72℃延伸1min，共31个循环，72℃最后延伸7min。VP1基因内套：95℃预变性5min后循环开始，95℃变性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸50s，共31个循环，72℃最后延伸5min。C.5.3产物大小NS1基因产物大小：435bp。VP1基因产物大小：607bp。C.5.4PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%X脂糖凝胶电泳检测（120V，30min），通过凝胶成像系统观察结果。C.6结果判定NS1基因检测阳性对照出现435bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；VP1基因检测阳性对照出现607bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品同时出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阳性；未出现435bp、607bp目的片段时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测阴性；仅出现一个目的条带时，判定猫泛白细胞减少症病毒PCR检测疑似阳性，经基因测序后以测序比对结果为准。

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大熊猫源巴贝斯虫检测方法D.1显微镜镜检D.1.1样品采集在训练或麻醉状态下采集大熊猫静脉血至EDTA抗凝管，轻柔混匀血液和抗凝剂，备用。D.1.2血涂片编号准备载玻片并在磨砂面一端标上动物姓名、采样日期和样品编号。D.1.3血涂片制备D.1.3.1厚血膜的制备取1张已消毒的载玻片，将4~5μL血液滴至载玻片上，取另一载玻片一端接触血液，由里向外旋转，涂成圆形厚血膜，自然晾干。D.1.3.2薄血膜的制备取1张已消毒的载玻片，用毛细管吸取抗凝血滴至载玻片上一滴，取另一载玻片作为推片，推片的边缘紧贴载玻片，接触血液，使血沿推片的边缘散开，两张玻片保持25°~35°角，将推片向前推成舌状薄血膜，自然晾干。D.1.4血涂片染色常用的巴贝斯虫染色液为DiffQuick染色液，按照说明书进行血涂片染色，自然晾干后待检。D.1.5显微镜观察及结果判定将染色后的血涂片放置在显微镜下，先低倍找到视野，再调整至10×（倍）、100×（倍）目镜下检查，在红细胞中发现巴贝斯虫则判定为阳性。D.2核酸检测D.2.1样本采集在训练或麻醉状态下采集大熊猫静脉血至EDTA抗凝管，轻柔混匀血液和抗凝剂，收集全血200μL，备用。D.2.2待测样本DNA的提取与保存按照DNA提取试剂盒的操作说明提取样本DNA，冻存于-80℃冰箱备用。D.2.3对照设立阳性对照：取已知巴贝斯虫阳性质粒DNA作为阳性对照；阴性对照：以灭菌双蒸水作为阴性对照。D.2.4PCR反应引物根据巴贝斯虫18SrRNA基因序列设计以下引物：上游引物（5’-3’）：GTCTTGTAATTGGAATGATGG下游引物（5’-3’）：TAGTTTATGGTTAGGACTACGD.2.5PCR反应体系及条件D.2.5.1PCR反应体系见表D.1。表D.1巴贝斯虫PCR反应体系组分加入体积（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1.0下游引物1.0DNA模板2.0ddH2O8.5总体系25.0D.2.5.2PCR反应条件95℃预变性5min后循环开始，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃最后延伸10min。D.2.6PCR扩增产物大小产物大小：465bp。D.2.7PCR扩增产物检测取PCR扩增反应结束后的产物，经1.2%X脂糖凝胶电泳检测（120V，30min），通过凝胶成像系统观察结果。D.3结果判定阳性对照出现465bp的目的片段，阴性对照无条带，实验成立；待检样品出现465bp目的片段时，判定巴贝斯虫阳性；未出现465bp目的片段时，判定巴贝斯虫阴性。

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大熊猫西氏贝蛔虫检测方法E.1粪便检查样本采集收集大熊猫新鲜粪便，放置4℃保存待用。E.1.2漂浮法A）漂浮法使用的溶液配制：将氯化钠或者硫酸镁缓慢加入盛有沸水的容器内，搅拌，直至氯化钠或者硫酸镁不再溶解为止，冷却后盛装，备用；B）用竹签挑取黄豆粒大小的粪便于圆形直筒瓶（高约3.5cm，直径2cm）中；C）加入饱和盐水或者硫酸镁水，当液面接近瓶口时改用滴管滴加，使液面略高于瓶口又不溢出为止；D）在瓶口覆盖载玻片，静止15min~20min后镜检。E.1.3改良加藤厚涂片法A）透明液配制:量取蒸馏水和纯甘油各100mL，混合后，再加入3%孔雀绿或亚甲基蓝1mL，储瓶备用；B）取亲水玻璃纸（25mm×40mm×40µm）放入透明液中浸泡24h以上即可使用；C）将尼龙绢片（8cm×8cm）置于粪便标本上，使粪渣通过尼龙绢片