好氧发酵工艺与设备-好氧发酵产物的合成机制

第五章好氧发酵工艺及设备发酵工艺与设备黄力

好氧性发酵(aerobicfermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进黄原胶－多糖的发酵等等。糖的分解代谢包括EMP（糖的共同分解途径）和TCA（糖的最后氧化途径）。第一节好氧发酵产物的合成机制

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。

在28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有0.25mmol

L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。一、发酵对氧的需求溶氧对三种不同微生物生长的影响（一）溶解氧对发酵的影响若溶氧量低，微生物？

若溶氧量过量，微生物？临界氧浓度:溶解氧的浓度不影响微生物呼吸时的浓度称为临界氧浓度。1.影响耗氧的因素影响耗氧因素培养基的成分和浓度显著影响耗氧菌龄影响耗氧发酵条件影响耗氧2.临界氧浓度CCr:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。CCrQO2CLO2气膜气液界面细胞膜菌丝团发酵液液膜O2O2细胞液膜气泡中氧→气膜→气液界面→发酵液→胞外液膜→细胞膜→细胞内发酵液中氧的传递途径双膜理论气—液界面气膜液膜CiCL空气泡PO2PPi发酵液气相液相气体扩散方向（二）供氧与微生物呼吸代谢的关系比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g-1·h-1

摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

r=QO2.X影响需氧的因素

菌体浓度QO2

遗传因素

菌龄

营养的成分与浓度

有害物质的积累

培养条件（三）溶解氧浓度的控制氧传质方程N：体积传氧速率kmol/m3.

h-1KLa:以(C*-CL)为推动力的体积溶氧系数h-1cL：发酵液中氧浓度（kmol/m3）；c*：与气相中氧分压p平衡的发酵液氧浓度（kmol/m3）；设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数KLα。2.发酵液中氧的饱和度C*主要受温度、罐压及发酵液性质的影响。而这些参数在优化了的工艺条件下，已经很难改变。因此，在实际生产中通常从提高氧的体积传质系数KLα着手，提高设备的供氧能力。影响KLα的工艺措施1、搅拌增加溶氧、促进微生物悬浮混合2、空气流度随空气量的增加而使氧传递系数KLα增大3、挡板改变液流的方向，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。4、空气分布管空气分布管的形式、喷口直径、管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较大的影响。5、加入传氧中间介质一方面起到表面活性剂的作用，降低表面张力，增大了单位体积液体中气液界面面积；另一方面，在气泡周围的氧载体与气液界面之间形成一层薄膜，增大了通过水膜进入水相的推动力，从而提高了传氧速率。6、温度的影响降低发酵温度可以得到较高的溶氧值。7、氧分压增加罐压和增加空气中氧的含量可提高溶氧值。二、谷氨酸发酵机制磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413反馈抑制苹果酸脱氢酶CO2参与嘌呤和嘧啶的合成脂肪酸天冬氨酸参与蛋白质合成参与蛋白质合成丙酮酸脱氢酶（三）谷氨酸生物合成代谢调节（1）完全氧化能力降低（生物素亚适量）（2）蛋白质合成能力降低（α－酮戊二酸）（3）环境条件对谷氨酸合成的调节（4）增加细胞膜对谷氨酸的渗透性谷氨酸产生菌因环境条件变化而引起的发酵转换环境因子发酵产物转换溶解氧谷氨酸乳酸和琥珀酸α－酮戊二酸（通气不足）（适中）（通风过量，转速过快）NH4+α－酮戊二酸谷氨酸谷氨酰胺（适量）（缺乏）（过量）pH值谷氨酰胺，N-乙酰谷酰胺谷氨酸（pH值5～8，NH4+过多）（中性或微碱性）磷酸缬氨酸谷氨酸（高浓度磷酸盐）（磷酸盐适中）生物素乳酸或琥珀酸谷氨酸（过量）（限量）影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质生物素油酸表面活性剂其作用是引起细胞膜的脂肪成分的改变，尤其是改变油酸的含量，从而改变细胞膜通透性一二青霉素：抑制细胞壁的合成甘油化学法物理法：针对温度敏感型菌株，只需要控制温度即可三、柠檬酸发酵机制柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文俗名citricacid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。菌种：黑曲霉(Aspergillus.niger)

原料：糖，乙醇，乙酸

途径：EMP（HMP）丙酮酸羧化

TCA循环黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：1；生产柠檬酸时为4：1。葡萄糖柠檬酸(citricacid)

理论转化率？（一）柠檬酸产生菌柠檬酸产生菌青霉属毛霉属其他（真菌或细菌）黑曲霉作为高产柠檬酸的特征以葡萄糖为唯一碳源时生长受到限制能够耐受住高浓度葡萄糖，且大量产生活力高的酸性α-淀粉酶和糖化酶能够耐受住但不分解高浓度的柠檬酸抗微量金属离子可产生菌丝球具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时产生很少或不产生ATP（二）柠檬酸的生物合成途径若要大量积累柠檬酸，我们该如何做？1.阻断代谢途径2.要设法满足菌体代谢活动最基本需求（三）柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制可通过哪些代谢途径的调节或调控方式达到积累柠檬酸的目的？1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节2.Mn2+的调节

Mn2+

缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn2+

缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。3.顺乌头酸酶活性的控制在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累，顺乌头酸酶在催化时建立如下平衡，柠檬酸：顺乌头酸酶：异柠檬酸=90：3：7。4.及时补加草酰乙酸外加草酰乙酸选育回补途径旺盛的菌种措施5.溶氧浓度对柠檬酸发酵的影响乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。

当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。

小结：

积累柠檬酸应采取的措施：想方设法提高柠檬酸合成反应所需酶的活力；

必须切断柠檬酸的去路；顺乌头酸酶失活，

TCA循环阻断。保证中间产物的供给；草酰乙酸的及时供给。

（四）柠檬酸的产率1.葡萄糖丙酮酸乙酰辅酶A（CH3CO-CoA）2.葡萄糖丙酮酸四碳二羧酸柠檬酸（C6H8O7）柠檬酸积累机理概括如下：1）锰缺乏抑制蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4浓度升高和一条呼吸活性强的侧系呼吸链不产生ATP，其解除了对磷酸果糖激酶的代谢调节，促进了EMP途径畅通。2）由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。3）在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累，顺乌头酸酶在催化时建立如下平衡，柠檬酸：顺乌头酸酶：异柠檬酸=90：3：7。4）丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。5）柠檬酸积累增多，pH低，在低pH时，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。四、其他好氧发酵产物的合成（一）核苷酸发酵核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。

核苷酸类中的肌苷酸（IMP）、鸟苷酸（GMP）、黄苷酸（XMP）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜40倍，鸟苷酸钠比味精鲜160倍。

5’－鸟苷酸

5’－肌苷酸

5’－黄苷酸（guanylicacid）（inosinicacid）（xanthylicacid）

5’-GMP

>

5’-IMP>5’-XMP（1）核苷酸的生物合成途径从头合成途径（denovo途径）由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）,然后转变为其它嘌呤核苷酸。

葡萄糖

HMP

5’－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）

PRPP转酰胺酶

5’-IMP腺苷酸腺苷酸琥珀酸

黄苷酸

鸟苷酸（2）补救合成途径（salvagesynthesis）微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成单核苷酸。当全生物合成途径受阻时，微生物可通过此途径合成核苷酸。2.核苷酸生物合成的代谢调控PRPPPRAIMPXMPGMPSAMPAMP反馈阻遏PRPPPRAIMPXMPGMPSAMPAMPGDPADPATPGTP反馈抑制1.GMP+AMP阻遏PRPP转酰苷酶形成

2.ATP是XMP合成GMP反应的供能体

GTP是SAMP合成AMP反应的供能体

3.若大量合成IMP，则培养基中不能有组氨酸的存在（二）抗生素发酵什么是初级代谢产物和次级代谢产物？抗生素是属于初级代谢产物还是次级代谢产物？初级代谢产物和次级代谢产物分别在什么时期产生？1.次级代谢产物的特征次级代谢产物是由微生物产生的，不参与微生物的生长和繁殖。次级代谢产物的生物合成是与初级代谢产物合成无关的遗传物质有关次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期（trophophase）和生产期（idiophase）一般都产生结构上相类似的多种副组分生产能力受微量金属离子和磷酸盐等