酵母生物学研究的几个问题

酵母生物学研究的几个问题

1工业酵母的分类母细胞象是一种低水平的真核生物。它不仅具有类似原核生物的生长特性（易于栽培、快速繁殖、易于遗传移动等），而且具有典型的真核生物特性。酵母作为人类利用最早的微生物,和人类的生活极其密切,是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的工业微生物。酵母生物学研究的最显著特点是基础理论研究与应用实践研究的内在统一,酵母不仅是研究真核细胞各种生命过程的有用模型和重要工具,而且也是外源真核生物基因表达的适宜宿主生物,对现有工业酵母菌种遗传改良和重组基因工程酵母生产外源蛋白显示出广阔的前景。酵母并非为一个严格的分类学概念,它是一类单细胞世代较长的低等真核生物的统称。至少包括80个属,600个种,10000多个独立菌株。常将其分成3大类:(1)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),又称面包酵母,有真核生物中“大肠杆菌”的美名,主要以发酵糖类产生乙醇和CO2为主要特征。一般人们讨论的酵母就是这一类酵母,它们是工业酵母应用中最重要的一类。(本文以下不特殊说明的酵母就指酿酒酵母)(2)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),人们对其研究远远不及酿酒酵母,其在分子及细胞生物学方面更加接近高等真核生物,以无性裂殖为特征,其单倍细胞仅有3条染色体。(3)非常规酵母(Nonconventionalyeast),除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称,近年这一类生物资源引起了人们的强烈兴趣,它的一些菌种为条件性致病菌,如Candidaalbicans(白假丝酵母,即“白色念球菌”),引起人们兴趣的主要原因是非常规酵母在生物工程方面的应用前景很广阔,对Pichiapastoris(巴氏毕赤酵母,即甲醇酵母)、Kluveromyces(克鲁维酵母)、Candida(假丝酵母)、Rarrowia和Hansenula等属酵母的一些菌株已建成了基因表达系统,其中尤以Pichiapastoris和KluveromycesLactis较为重要。2遗传多样性研究酿酒酵母的工业应用比较广泛,历史悠久,遗传背景清楚,不产生有毒物质,生物安全性好,易于推广应用,现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型。2.1双链环形dna的制备酵母细胞核内有16条染色体,基因组为12052kb,核外线粒体mtDNA为长约25μm(约75kb)的双链环状分子,常见内源质粒为2μ双链环状DNA(6kb,周长约2μm),每个单倍体基因组含质粒60～100个拷贝。酵母基因组与高等真核生物基因组相比,最突出的特点是其紧密性(compactness),共有6138个ORFs,编码蛋白质的基因预计共有5800个,约有6%～7%为不编码蛋白质的基因。2.2菌株结构及染色体结构酵母细胞染色体在有丝分裂或减数分裂期间能高度有序地传递给子细胞,已知有3种结构成分对染色体有效、稳定遗传是必需的:(1)ARS(autonomouslyreplicatingsequence自主复制序列),染色体自主复制序列,是从酵母中克隆的真核细胞DNA复制起点序列。酵母每条染色体由多个复制子组成,复制子平均长度为36kb,整个基因组约由400多个复制子组成。(2)CEN(centromeresequence着丝粒序列),着丝粒是真核细胞染色体在细胞分裂中精确分离的必需结构,每个染色体都具有一个着丝粒,现已分离了多个CEN序列,其大小为900～600bp,CEN不具有染色体专一性,却具有种属专一性。(3)TEL(telomericsequences端粒顺序),线性染色体DNA保持复制稳定性所必须的端粒顺序,为富含TG的长约3000～4000bp的序列,酵母和四膜虫的TEL基本相似,可以通用。YAC(yeastartificialchromosome酵母人工染色体)将上述酵母染色体3种基本功能性成分及选择标记基因有效组合构建了酵母人工染色体(Murray,Szostak1983),YAC实际应用中都以穿梭载体的形式构建,含有pBR322中的Ampr和Ori,酵母中常用的选择基因为TRP1,URA3和SUP4,YAC中的TEL序列也可来自四膜虫。YAC承载的外源基因片段为200～1000bp。2.3母类基因调控区的基本原理酵母基因组虽小,但其表达调控过程与其它真核生物相似,酵母作为真核基因表达载体,用于大量生产外源蛋白质,是真核生物基因表达研究的理想工具。(1)酵母的转录由3种RNA多聚酶催化,编码RNA聚合酶的基因与其它真核生物3种RNA聚合酶基因同源性很高。对酵母反式作用因子(转录因子)GAL4、ADR1、PPRI等研究,发现绝大多数酵母转录因子的特征激活结构域能促进哺乳动物细胞的基因转录,然而若干哺乳动物转录因子的激活结构域并不促进酵母基因的转录。(2)酵母Ⅱ类基因调控区的基本结构特点:结构基因上游大约100bp处含一个或多个TATA盒作为核心启动子,在位于Cap位点上游几百bp处是上游激活序列(UAS),UAS结构和功能方面类似于哺乳动物中的增强子,转录总是在TATAbox下游80～120bp的特定位置开始。结构基因3′末端有效的终止子终止转录。(3)酵母mRNA具有典型的真核结构:5′-帽子,3′-polyA,成熟的mRNA以初级转录物经拼接后成熟产生,酵母只有很少的基因具有内含子,且无操纵子结构。酵母基因的翻译效率受基因编码序列上游DNA序列的影响,一般要求起始密码子ATG前保留一段短的、不变的前导序列,它对转录的起始并非必需,但对mRNA的高效翻译却相当重要。(4)酵母作为真核生物的另一特征是能对翻译产生的前体蛋白质进行加工以产生功能性产物,而且加工往往与分泌作用相偶联:a.酵母表达载体构建中常用的分泌信号为酵母的MFα1前α一因子前导序列(prepro-2-factor或ppαfl),分泌表达多肽的分子量范围为24～842个氨基酸,一般不大于30KD,其它分泌信号有:蔗糖酶信号肽、PH05碱性碱酸酶信号序列、黑曲霉糖化酶信号序列,酵母不但能利用自身的分泌信号(较多),也能利用异源的分泌信号;b.酵母有与真核生物相似的表达蛋白加工转运途径,在分泌表达时,能正确形成二硫键和糖基化加工,外源蛋白在酵母中能发生N—C和O—C连接的两种不同糖基化,每条糖侧链平均50～150甘露糖残基,即存在过度糖基化倾向,且有时在核心多糖末端存在α-1.3糖链,从而使得有的糖蛋白呈较高的抗原特性。2.4酵母细胞表达系统的研究,为基因研究提供了基础1978年Hinnen等及Btggs完成了外源DNA引入酵母原生质体的实验,酵母2μ质粒及其它载体也相继完善,酵母转化技术有了突破,酵母的分子克隆技术及分子遗传学也迅速深入发展。为了克服大肠杆菌表达系统的缺点,发展了酵母细胞表达系统,它除了对其基础研究起了很大作用外,也为基因工程药物和疫苗的产业化做出了巨大的贡献。现有许多关于细菌、真菌和高等动植物基因在酵母中成功克隆和表达的报道,其中有许多重要蛋白已经应用酵母工程菌进行生产。2.4.1对编码蛋白表达的调控酵母细胞中基因克隆和表达的载体一般有5种类型(见表1)。其中以2μ环为基础构建的YEP最常用。表达载体与克隆载体不同的是除复制子和选择基因外,还需包含表达必须的DNA区段:(1)一个或多个供插入外源蛋白质编码序列的限制性酶切位点;(2)核心是其上有一个可调控转录表达的酵母启动子;(3)启动子下游是先导序列(和翻译效率有关),ATG(起始密码);(4)往往还含有编码有用蛋白质结构域的序列:信号肽序列,核定位序列,某种抗原表位或其它标签蛋白序列。常用的酵母高效表达载体多是YEP类型的质粒,其中包含的酵母强启动子有PGALI.(半乳糖激酶启动子)、PPHO(碱性磷酸酶启动子)、PAPLI(乙醇脱氢酶启动子)、PPGK(3-磷酸甘油酸激酶启动子)。启动子上游往往包含了其上游激活位点(UAS序列)。可诱导启动子用于质粒编码蛋白的条件控制性表达,特别是当某基因产物对宿主酵母有毒性时,最好作诱导表达,如PGALI,在培养基含有葡萄糖时,PGALI转录活性低(每细胞少于1个转录物),而在以半乳糖为唯一碳源的培养基上时,PGALI可大量转录。对于PPHO5,当培养基富含无机磷时,PPHO5活性很低,当培养基缺乏无机磷时,则可诱导PPHO5的转录活性。组成型启动子中PADH1最常用,也可用PPDK。随细胞所处的代谢状态(生长培养基)的改变,组成型启动子的活性也可改变,但这种活性的改变没有诱导的启动子那么剧烈。2.4.2筛选后转化体的制备构建好的载体质粒都要通过转化将外源DNA导入宿主酵母细胞中,再通过筛选操作分离得到转化体。酵母转化系统的选择标记基因(M+)与相对应的突变基因(M-)的菌株配套使用,不同选择标记有不同的筛选方法(多为营养缺陷互补),转化方法可分以下两种。(1)常用快速法a最常用的转化方法是乙酸锂转化法,操作快捷,转化效率高(可达105～106转化体/μgDNA),分为一般法和快速法两种。快速法省时实用,转化频率却较低。在乙酸锂转化法中,Li+的最适浓度为100mmol/L,受体酵母浓度为5×107细胞/mL,pH为7.0,为维持高转化频率,体系中需加聚乙二醇(PEG4000或PEG3350),乙酸锂可用硫氰化锂代替。(2)酵母细胞的分离和制备首先将酵母用酶法去壁成原生质体后再进行外源DNA导入,筛选出的转化子再使细胞壁再生,操作过程需将原生质体保持在一定合适渗透压的培养基中。操作步骤多而费时,原生质体非常脆弱,不能直接筛选(药物),且原生质体可能融合产生多倍体细胞,对依其表型筛选造成困难,而直接法就不存在这些问题。酵母细胞亦可通过电脉冲穿孔法转化。在酵母转化过程中,特别是使用乙酸锂方案时,转化时添加变性的单链相对高分子量单体DNA对提高转化效率十分重要,一般是将从鲑鱼睾丸制取的双链DNAШ钠盐用TE溶液溶解并经超声波处理成2～15kb(最好为平均7kb)的片段,在转化时同质粒DNA同时加入转化体系。3外源基因表达数据库设计不合理,实氧条件下发酵生物酶系统发育酿酒酵母作为一种基因工程表达系统存在一定的局限性:(1)酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母,多不适于高密度培养,而大多数外源基因表达需要的是以好氧条件下的营养生长蛋白质合成为条件,用酿酒酵母系统表达外源基因很难达到很高的水平;(2)酿酒酵母缺乏强有力的受严格调控的启动子;(3)酿酒酵母对外源基因表达产物的分泌不够理想;(4)表达菌株不够稳定,表达质粒易丢失,此外在翻译后加工方面也与高等真生物有所不同。3.1甲醇酵母糖苷链反应型甲醇酵母(Pichiapastoris)的生物学特点:甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶(AOX)作用下被氧化成甲醛。调控AOX的启动子是强启动子,用来调控外导源蛋白质的表达,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为唯一生长碳源时,诱导基因转录,常用的受体菌为GS115,KM71和SMD1168,都为组氨酸缺陷型。甲醇酵母作为真核表达系统的优点:(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOXI)启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2)可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰,糖基化程度低,糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基,较之酿酒酵母50～150甘露糖残基短得多,核心多糖末端不存在a-1.3糖苷链;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,便于工业化生产;(4)可高密度发酵培养,表达量高,在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上,许多蛋白可达到每升克以上水平;(6)表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌至胞外,Pichia自身分泌的蛋白非常少,十分有利于纯化。3.2pasdur表达质粒的筛选P.pasteur质粒主要应用YIP整合性载体,转化最常用的仍为乙酸锂法。其转化体筛选以His,Ura3营养缺陷型筛选为主,特征载体(PPTC3K,PPTC9K)可用抗G418筛选。典型的pasteur表达质粒结构仍为穿梭性载体,载体的一般结构为:(1)5′AOX1,含AOX1启动子及调控序列,同时也是载体和宿主发生重组的位点;(2)MCS;(3)Sig信号肽;(4)TT转录终止和polyA序列;(5)3′AOX1,TT下游区及同源重组位点;(6)筛选标记及E.coli中的克隆基因。为了提高外源基因整合到基因组中的拷贝数,常在表达质粒中串联几个“启动子+外源基因+转录终止区”这样的表达单位,一次整合,即可有多个表达单位插入基因组。4关于研究和应用的期待4.1酵母生物基因筛选工具(1)在生物信息领域,通过对酵母基因组数据库的检索、类比分析,在人类基因组研究中已显示出巨大潜力。在酵母中进行功能互补实验是一种研究人类基因功能的捷径,为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统,酵母成为其它生物新基因的筛选工具。期望构建的酵母最小基因组将会更加方便和有用。(2)以酵母为主的不断完善发展的分子生物技术已成为真核分子生物学研究的重要工具。主要包括:酵母单杂交系统(one-hybridSystem),双杂交系统(two-hybridsystem),逆向双杂交系统(reversetwo-hybridsystem),三杂交系统(three-hybridsystem),作为研究蛋白质(转录因子)与DNA,蛋白质与蛋白质,两个蛋白质与另外的蛋白、RNA和小分子药物等相互作用重要的生物体内试验方法以及筛选顺式作用元件等的重要工具。酵母的单倍体-双倍体可控制生长和产子囊孢子生长特性,为遗传研究带来许多方便。4.2酵母基因在食品和发酵工业中的应用各种酵母在生产领域有着广泛的应用历史与前景。酵母作为各种特殊蛋白的表达系统,在生产特殊活性肽(疫苗、药物等)方面已取得成功应用,并且随着研究的深入还会得到更广泛的应用,这里仅对酵母基因工程在食品和发酵工业几个方面的应用作以简述。4.2.1和sta3国内外最早的研究都集中在对酿酒酵母利用淀粉、寡聚糖和糊精的分泌酶进行基因工程改良上,最早被克隆并引入的是Saccharomylesdiastaticus(糖化酵母,但不耐酒精)的STA1,STA2和STA3,基因引进后以PGK为启动子,ARS1为复制子,但2μm质粒存在稳定性不好的问题。Yocum(1986)将黑曲霉的葡糖淀粉酶(GA)基因通过YIP整合在酵母染色体上,遗传稳定性及酶活能满足生产要求,存在问题是真菌糖化酶耐热,不能为巴氏灭菌灭活。Schiwaniomycesoccidentacis的GAM1基因整合剂ADH1(乙醇脱氧酶)在基因启动子下,可达正常工艺要求,生产出低糖(干)啤酒。分泌β-葡聚糖酶可降低啤酒汁粘度,改善过滤性能,该酶基因来自木霉(Trichodermareesci)的EGL1或大麦,分泌融合表达,整合入PPGK1下可改善过滤,不影响持泡特性。4.2.2-羟基丁酮和氨酸丁酮的合成双乙酰作为啤酒成熟的主要标志,它来自丙酮酸经α-乙酰乳酸合成缬氨酸途径的副产物,α-乙酰乳酸为双乙酰的主要前体。通过引入α-乙酰乳酸脱酶(ALDC)基因(来自醋酸杆菌或乳酸菌)整合到酵母的URA3或rDNA上,ALDC则氧化α-乙酰乳酸为3-羟基丁酮,从而达到降低双乙酰的目的,缩短后熟时间和对缬氨酸生物合成途径的基因(ILV)克隆和遗传操作使ILV2缺失,且插入ILV3,使酵母双乙酰产量明显降低。啤酒酵母工艺性状是一个复杂的多基因群体作用,对其联合综合改良,是否会超出酵母的生理承受极限,搅乱其自身的遗传特性,这将是“途径工程”面临的新挑战。4.2.3改良酵母蛋白质酵母细胞营养丰富,一直作为人类及其它动物重要的营养强化剂。按其应用主要分为食用营养酵母(foodyeast)和饲用酵母(feedyeast),具有很大的市场发展空间。酵母作为最重要的单细胞蛋白(SCP)微生物,应用基因工程,改良酵母蛋白质也作了不少工作。Hinch