dhea法与雌激素联合hcg法建立的多囊卵巢综合征大鼠模型

dhea法与雌激素联合hcg法建立的多囊卵巢综合征大鼠模型

多囊卵巢综合征（pco综合征）是发育期妇女常见的繁殖疾病。其特点是卵巢强度障碍、高雄激素血症和多囊卵巢囊肿。通常从青春期开始发病，发病率约为6%10%。临床症候具有高度异质性,不同患者的病理生理特征差异较大,发病机制不清,患者主要以药物治疗为主,临床标本获取较困难,故对其发病机制及治疗机制的人体研究存在诸多局限,寻找理想的接近人类PCOS病理特征的动物模型对深入研究PCOS的发生发展及治疗有深远意义。本研究对孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(hCG)法以及脱氢表雄酮(DHEA)法2种方法构建的PCOS大鼠模型进行实验研究,以期为后续研究提供适宜的动物模型。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物SPF级21日龄Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠120只(购于广东省医学实验动物中心),体重45～55g。1.1.2诺酮硅胶棒DHEA粉剂(施瑞科技);左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(上海达华制药);注射用hCG(丽珠制药);大鼠胰岛素检测酶免(ELISA)试剂盒(广州达瑞抗体工程技术有限公司)。1.2实验方法1.2.1模型大鼠b.孕棒的模型评价120只SD大鼠按随机数字表分为4组:模型组I、II各44只,对照组Ⅰ、Ⅱ各16只。模型组Ⅰ大鼠于24日龄5%利多卡因局麻后,股部内侧皮埋避孕棒,每只3～4mm。对照组Ⅰ不予处理;于27日龄时,模型组Ⅰ大鼠开始颈背部皮下注射hCG1.5×103U/L和0.2ml生理盐水,对照组Ⅰ大鼠皮下注射生理盐水0.2ml;连续用9d后停药。模型组Ⅱ大鼠于24日龄时开始,每天颈背部皮下注射DHEA3mg/100g和0.2ml注射用油剂,对照组Ⅱ大鼠皮下注射注射用油剂0.2ml;连续注射20d后停药。停药后,连续阴道涂片7d,观察阴道上皮周期性变化,初步判断建模是否成功。1.2.2血清状态及指标检测①从大鼠阴道口开放日龄起,每日8:00及20:00观察并记录大鼠阴道口开放情况;②动情周期变化,阴道涂片并湿片观察阴道脱落细胞形态变化;③相关指标检测:模型组Ⅰ大鼠在42日龄、模型组Ⅱ大鼠在51日龄、对照组大鼠在阴道涂片示动情间期时,晚8:00禁食,次日晨8:00称重。腹腔注入10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血5～8ml。静置0.5h后将全血3000rpm/min离心10min得血清。血糖仪测定空腹血糖值(FPG);大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定空腹血清胰岛素水平(FINS);血清雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)采用微粒子酶免分析法测定。按照公式计算稳态模型评估(HOMA)指数=FINS(mμ/L)×FPG(mmol)/22.5;④卵巢形态学观察,在采血同时各组另取大鼠解剖双侧卵巢,尽量分离去除卵巢周围脂肪组织,滤纸包裹后迅速置于电子天平称其湿重,计算卵巢指数(OC,表示卵巢组织的单位重量);甲醛固定称量后的卵巢,石蜡包埋切片,HE染色。1.3统计方法数值变量以均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,所有数据采用SPSS13.0软件分析,组间比较采用t检验。2结果2.1模型组和对照组的选取模型组Ⅰ为31±3d,对照组Ⅰ为36±2d;模型组Ⅱ为27±2d,对照组Ⅱ为35±2d。模型组大鼠阴道口开放日龄均早于对照组(t=2.534,P<0.001)。2.2主2转移间期模型组Ⅰ中38只大鼠、模型组Ⅱ中34只大鼠连续阴道涂片观察显示持续处于动情间期,提示无排卵。两对照组显示有规律的动情周期,两模型组失去规律动情周期的大鼠的比例分别为86.4%和77.3%(P<0.05),模型组Ⅰ建模成功率高于组Ⅱ,有统计学差异。2.3对照组p>0.05模型组I体重、卵巢湿重、卵巢指数等均高于对照组(P<0.05);而模型组Ⅱ体重较对照组明显减轻,但解剖发现其卵巢重量及卵巢指数均高于对照组(P<0.05),见表1。2.4iii血清统一血清的i、e、p、t水平比较模型组I血清P、T水平较对照组升高(P<0.05),但E2水平与对照组相差不大。模型组II血清E2、P、T水平均较对照组高(P<0.05)。两种建模方法显示FPG、FINS及HOMA指数均高于相应对照组,两模型组行两样本t检验,血清E2、P水平有统计学差异(P<0.05),余指标无明显差异,见表2。2.5关于海南岛的形态2.5.1一般形状对照组卵巢色泽红润,卵巢表面多个黄体;模型组卵巢表面苍白,体积增大,卵巢表面多个扩张的透明囊泡。2.5.2黄松砂模型的成分模型组Ⅰ(图1)光镜下见多个扩张的囊泡,闭锁卵泡常见,囊泡内卵母细胞或放射冠消失,颗粒细胞层数减少(2～3层),排列疏松,极少见黄体形成;模型组Ⅱ(图2)中见多个扩张的囊泡,颗粒细胞疏松,可见黄体组织;对照组(图3、4)大鼠卵母细胞清晰,颗粒细胞层数多(6～10层),排列紧密,有黄体形成。3妊娠合并心脏病模型构建因大鼠有较稳定的动情周期,利用其开展实验研究经济方便,一直是PCOS建模的首选。PCOS动物模型的建模方法众多,如雄激素建模法、雌激素建模法、孕激素联合hCG建模法、胰岛素联合hCG建模法、芳香化酶抑制剂建模法及近年来雄激素联合hCG建模法等。本实验从中选取了目前较为公认的两种方法进行了验证和比较。目前普遍认为下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴功能紊乱导致的促性腺激素(Gn)分泌异常,主要是黄体生成激素(LH)分泌增加,是PCOS发病的中间环节。LH与高雄激素血症、胰岛素抵抗等典型PCOS的病理生理变化均密切相关。早在1989年BogovichK就提出孕激素联合hCG建模法。其机制是皮下埋植缓释孕激素避孕剂左旋18-甲基炔诺酮抑制HPO轴,使性激素分泌呈低水平,导致不排卵。而hCG发挥类LH的作用,在卵泡早期使用致卵泡闭锁,故孕激素联合使用hCG可构建PCOS动物模型。大量临床研究发现,PCOS多起病于女性的围初潮期。青春发育前2年,肾上腺重量及肾上腺皮质厚度增加,肾上腺雄激素合成分泌增多,临床上表现为血清DHEA和硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)水平显著升高,促进了伴有肾上腺源性雄激素升高的PCOS的发生。在此理论基础上,1991年Lee等首先用DHEA成功构建了类PCOS模型,机理为:DHEA是孕烯醇酮经△5途径转化为雄烯二酮的中间产物,该途径受LH的调节。通过外源性途径提高DHEA水平造成雄烯二酮水平增高,进而睾酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血症,升高的雌酮水平对FSH负反馈使促卵泡素(FSH)相对不足,卵泡发育停滞,从而导致排卵障碍及卵巢多囊改变。有学者提出PCOS“青春期发育亢进学说”,假性性早熟已被确定为儿童日后发展成PCOS的危险因素之一。故以刚离乳SD大鼠作为研究对象的建模方法更符合临床实际而受到研究者的推崇,本实验也选取刚离乳的幼龄SD大鼠开始建模。研究结果显示,两种方法建立的PCOS模型与对照组相比,在青春期表现出早熟、高雄激素、胰岛素抵抗及卵泡大量闭锁卵巢多囊性改变等,基本具备了临床PCOS患者基本的病理生理学特征。本研究显示,孕激素联合hCG建模法采用皮下埋植孕激素避孕棒缓慢而稳定地释放孕激素,用生理盐水溶解hCG皮下注射,方法简便易于操作,建模周期较短。DHEA因其不溶于水配制成油剂,注射后短期内很难完全吸收,吸收率的差异会影响大鼠建模成功率的高低,国内外实验各种指标存在较大差异。本实验在实际操作中出现DHEA粉剂不易溶解,注射油剂时较困难,注射部位局部皮肤出现硬结影响药物吸收等问题,较难操作,且相比孕激素联合hCG建模所需时间长。孕激素联合hCG建模组大鼠表现为明显的肥胖,血清E2呈低水平,而DHEA建模组未出现明显的肥胖,相反还出现了体重较对照组减轻,E2水平也高于对照组,与临床PCOS表现不同。这些结果说明,避孕硅胶棒联合hCG建模组大鼠的形态学和内分泌学改变都与PCOS患者极为相似,是较为理想的PCOS动物模型。本研究结果与桂文武等、朱亮等、夏燕等的结果较吻合。结合实际应用,由于所用避孕棒长期而持续地释放孕激素抑制HPO轴,一方面模型的持续时间长,可用于做药物疗效的长