表皮生长因子对糖尿病大鼠伤口愈合的影响

表皮生长因子对糖尿病大鼠伤口愈合的影响

为了研究外源性生长因子对糖尿病难治伤口愈合的影响机制，一直是近年来伤口愈合研究领域的热点。在本研究中，我们使用了糖尿病大鼠背部病变模型，比较了治疗组和对照组之间的伤口损伤能力，并确定了egf对伤口成纤维细胞的复制机制。对于前胶原原（i）的mrna水平，我们对egf在难治伤口中的作用机制进行了初步研究。材料和方法1氧吡啶致伤方法健康雄性SD大鼠40只,体重200~250g,随机分为正常组(n=12)、糖尿病组(n=28)。正常组大鼠腹腔注射1.5ml生理盐水,糖尿病组大鼠腹腔注射新鲜配制四氧嘧啶(1.5mg/10g体重),测得血糖值大于10mmol/L(1800mg/L),并维持2天后,即可致伤。致伤在无菌条件下进行,大鼠麻醉、脱毛后,沿脊椎方向用外科方法做两条深达筋膜长约4cm的平行切口,伤口距脊椎垂直距约为1cm,缝合伤口。在糖尿病治疗组切口伤基底处注入20μl100U/ml的EGF液,糖尿病自身对照组及正常组伤口基底注入20μl牛血清白蛋白(5mg/ml)液。2fps测定参照文献。生长融合的伤口成纤维细胞经0.25%的胰酶消化,1640液洗涤,用1640/1%FCS培养液将细胞团调成1×106个/ml的细胞悬液,点接细胞悬液100μl到96孔培养皿中,37℃、5%CO2条件下孵育12小时,细胞呈贴壁生长,吸去培养液,对照组加入1640/5%FCS100μl,EGF组加入100μl100U/mlEGF、1%FCS1640液与细胞孵育48小时后,每孔培养皿中加入10μlMTT(5mg/ml),37℃继续培养4小时,再加入100μl10%SDS,37℃保温18小时后,在酶标仪(Bio-Rad450型)570nm波长处测定每孔溶液的光吸收值,两种待测液平行测定6个样品。3细胞中总rna提取待伤口修复细胞培养融合后,用Hank’s液洗2次,对照组加入20μl含1%FCS1640液,EGF组加入20μl100U/mlEGF、1%FCS1640液,37℃,5%CO2条件下孵育0.5、4、8、12小时后,取出培养细胞,每一时相点每组细胞总数大于1×107/ml,按TotalRNAIsolatiomKit标准程序提取细胞中的总RNA,260nm、280nm定量,检测纯度后,-20℃保存。前胶原Ⅰ型(α1)1.8kbcDNA片段来源于质粒Hf677EcoRI酶切位点,用随机引物法将α-32P-dCTP掺入到探针中,标记产物比活度大于1×109/ngDNA。用真空加样器将对照组、EGF治疗组细胞总RNA各20μg点接到尼龙膜(Boehringer,Germany)上,同一组别平行点接2个样品,80℃真空干燥2小时,装入杂交袋中。按《分子克隆指南》标准程序行斑点杂交及放射自显影,显影胶片用计算机定量扫描处理。4大鼠口服抗张力测定伤后7、10、14天,分别从正常组、糖尿病组中随机选取大鼠4~8只活杀,沿伤口垂直方向剪取伤口中央段1cm宽皮条,在张力仪上测定伤口抗张力值。结果1egf对伤口纤维细胞的克隆作用EGF组光密度值为(0.351±0.097),显著高于对照组(0.213±0.063),EGF能促进伤口成纤维细胞的增殖。2egf对伤口前胶原细胞前胶原基因的发现的影响按每微克总RNA对应的扫描相数值比较EGF作用不同时间后伤口成纤维细胞前胶元Ⅰ(α1)mRNA水平量,比较结果见附图。3治疗组和对照组在受伤后的抗破裂能力之间的比较伤后不同天数各组伤口抗张力值见附表。从附表可见,糖尿病治疗组与正常组和糖尿病自身对照组比较差异非常显著(P<0.01)。egf基因调控规律糖尿病伤口愈合迟缓是临床上常见的难题,其有关机理尚不完全清楚,伤口愈合过程表现为修复细胞的迁移、聚集、增殖、分化、血管再生及胶元合成等。文献报道,糖尿病或正常小鼠皮肤中生长因子的含量无差异,但致伤后正常小鼠伤口中EGF、FGF等生长因子的峰值水平及mRNA转录明显早于难愈性伤口。有关研究人员观察到糖尿病小鼠伤口处多种细胞因子PDGF、EGF、bFGF、aFGF的基因调控规律异于正常小鼠伤口愈合中的调控规律,表达时间延迟,表达强度下降。补充外源性生长因子如aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、EGF/胰岛素,可明显改善糖尿病伤口愈合多项参数。已在体外实验中证实EGF可直接促进伤口修复细胞的生长,EGF是否可直接刺激修复细胞表达胶原Ⅰ型基因,还未见文献报道。在本实验中我们也发现EGF对伤口成纤维细胞有明显的增殖作用,并促进成纤维细胞中胶元Ⅰ(α1)基因表达。皮肤切口伤伤口愈合程度直接取决于跨越沉积到伤口边缘处的Ⅰ型胶元(α1)合成量,且伤口肉芽组织胶元合成发生在基因转录水平,胶原基因表达受阻可因伤口肉芽组织中表达基因的细胞数目减少和表达强度降