抗鲫鱼小清蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

抗鲫鱼小清蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

丰富的饱和脂肪酸和脂肪维生素是人类的重要食物来源。但是,鱼类同时也是八大类致敏食物之一,在沿海国家因食用鱼类导致过敏的事件时有发生。美国约有0.4%的人群对鱼类过敏,并且这一数字呈逐年上升的趋势。我国吕相征等的调查结果显示,15～24岁健康人群中,约有1.1%对鱼类过敏。鱼类中的主要过敏原小清蛋白(parvalbumin,PV)是1971年Elsayed等从鳕鱼(Gaduscallarias)中发现的。小清蛋白的分子量为10～14kD不等,等电点(Isoelectricpoint,pI)在3.9～5.5之间,广泛存在于各种鱼类中。在小清蛋白的检测方面,虽然从鱼类过敏患者血液中获得的IgE抗体可用于检测鱼类过敏原,但其来源非常有限,且个体间和批次间存在一定的差异。与之相比,来源于动物的IgG抗体获取容易,通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体还可实现针对同一抗原决定簇的IgG抗体的长期稳定生产,有利于鱼类过敏原检测方法的建立及应用。迄今为止,国内外对鱼类过敏原的研究主要集中在海水鱼上,对淡水鱼过敏原的研究较少。我国是淡水鱼生产、加工和消费大国。2009年我国淡水养殖鱼类产量达1957万吨,占养殖鱼类总产量的71.8%。鲢鱼(Hypophthalmichthymolitrix)是淡水养殖的重要经济鱼类,也是我国“四大家鱼”之一,2009年产量约为348万吨。因此,在我国开展淡水鱼类过敏原的研究具有重要的理论价值和实际意义。本文以鲢鱼为研究对象,纯化其主要过敏原小清蛋白,并以纯化的小清蛋白制备特异性单克隆抗体,以期为鱼类小清蛋白检测方法的建立提供一定的基础。1小清蛋白的纯化鲜活鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鲫鱼(Carassiusauratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、罗非鱼(Oreochromismossambicus)及新鲜的蓝圆鲹(Decapterusmaruadsi)购自厦门集美农贸市场。冰鲜鲑鱼(Salmosalar)和冷冻鳕鱼(Pollchiusvirens)购自厦门千滋百味专业肉品连锁超市。分别取肉立即实验或保存于-70℃。DEAE-Sepharose、SephacrylS-200和硝酸纤维素膜购自Amersham公司;抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)为Sigma公司产品;蛋白分子量标准从Fermentas公司购得;HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体购自DAKO公司;3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)和ECL底物从Pierce公司购得;其他试剂均为国产分析纯。小清蛋白粗提物的制备方法参照Kobayashi等的方案并略做修改,即分别取每种鱼的肌肉2g,加入冰冷的4倍体积20mmol/LTris-HCl(pH7.5)。组织捣碎后,8000r/min,4℃,离心15分钟。所得上清即为小清蛋白粗提物。鲢鱼小清蛋白的纯化方案参照之前的报道进行。即将100g鲢鱼白色肉切碎后于4倍体积20mmol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液中组织捣碎,离心。将上清液经60%～100%硫酸铵盐析,静置2小时后离心,将沉淀溶于缓冲液中,透析,上样于DEAE-Sepharose离子交换柱。收集目的蛋白部分上样于SephacrylS-200凝胶过滤,即可获得纯化的鲢鱼小清蛋白。蛋白的浓度测定采用Bio-Rad蛋白检测试剂盒进行测定。将样品与染液室温孵育5分钟后,测定其在595nm的吸光值。以牛血清白蛋白为标准蛋白制备标准曲线。每个样品重复测定3次。选择雌性、6～8周龄的BALB/c小鼠,将纯化的鲢鱼小清蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀,充分乳化后,进行腹腔注射,剂量为每只小鼠100μg抗原。之后每隔2周以相同剂量的抗原进行腹腔注射,加强免疫。在细胞融合前4天,选抗体滴度最高的小鼠进行强化免疫1次。细胞融合实验参照Gajewski等的方法并做适当修改。分离强化免疫的小鼠脾脏淋巴细胞,将其与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合后的细胞于含有20%胎牛血清和1%HAT的RPMI1640培养基中,在37℃、5%CO2条件下培养。杂交瘤细胞通过下述的ELISA法进行筛选。筛选出的阳性细胞采用有限稀释法进行克隆化培养,该操作重复3次。将筛选的阳性细胞株对敏化的小鼠进行腹腔注射,约1周后获得腹水。采用ProteinGSepharose亲和层析柱对腹水中的抗小清蛋白单克隆抗体进行纯化。收集各部分样品进行A280nm检测以及SDS电泳分析。将纯化的抗体分装后保存于-70℃。SDS(sodiumdodecylsulfate-polyacryalmidegelelectrophoresis)参照Laemmli的方法进行。取制备的样品加入上样缓冲液,小清蛋白各阶段纯化效果及抗体特异性分析采用15%胶浓度进行,单克隆抗体纯化效果采用12%胶浓度进行分析。电泳结束后,以考马斯亮蓝进行染色。用脱色液(甲醇∶乙酸∶水=3∶1∶6,v/v)脱色至条带清晰后,在凝聚成像仪上记录结果。Westernblot参照Towbin法进行,即SDS电泳后,通过半干转转移装置将蛋白转移至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶室温封闭1小时后,采用制备的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体为一抗,HRP标记的兔抗小鼠IgG为二抗进行免疫印迹实验,加入ECL底物孵育2分钟后,在化学发光成像系统(FluorChemQ)上记录结果。ELISA法的操作参考Kobayashi等的报道略作修改。以ELISA法筛选能分泌抗小清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞时,以纯化的小清蛋白为抗原进行包被(200ng/孔),TBS-T洗涤5次,去除未结合的抗原,以5%脱脂奶室温封闭1小时。以细胞培养上清为一抗。TBS-T洗5次后,加入HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗进行反应,最后以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)显色,用2mol/LH2SO4终止反应后,在96孔板酶标仪(Bio-Rad)上测定450nm的吸光值。用ELISA法比较制备的单克隆抗体(A4-C1)与商品化单克隆抗体(PARV-19)的结合位点时,以纯化的小清蛋白为抗原进行包被(10ng/孔)。分别以A4-C1、PARV-19以及A4-C1+PARV-19为一抗(均为1∶5000),其他操作均同以上描述。每个样品平行3份。2结果2.1半干催化型细胞剂的盐析分离通过对鲢鱼肌肉肌浆蛋白进行硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose和SephacrylS-200柱层析后,获得了高纯度的天然小清蛋白。在肌肉粗提物中,小清蛋白的浓度较高,因此,通过改变缓冲液的组成可使目的蛋白与部分杂蛋白得到有效分离。作为一种有效的粗分离手段,硫酸铵的盐析效果如图1中泳道2所示。与泳道1的肌浆蛋白粗提物相比,60%～100%硫酸铵可有效去除66kD以上的杂蛋白,并对12kD左右的目的蛋白质起到一定的富集作用。泳道3为经过DEAE-Sepharose柱层析后的样品,显示该阴离子交换柱的除杂效果良好,能除去绝大部分的杂蛋白,并浓缩了目的蛋白。进一步通过凝胶过滤柱层析,利用分子量大小的差异,将27kD和43kD左右的杂蛋白完全去除,获得高度纯化的天然小清蛋白(图1,泳道4)。2.2抗小清蛋白的纯化及鉴定虽然商品化的抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)具有效价高、特异性好等优点,但其价格高昂,且来源于蛙,不利于实现对淡水鱼小清蛋白的准确定量。因此,本研究以纯化的鲢鱼小清蛋白为抗原,制备相应的单克隆抗体,以实现对鱼类特别是淡水鱼类小清蛋白的检测。通过一系列筛选,获得的能分泌抗小清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为A4-C1。将杂交瘤细胞株扩大培养后制备小鼠腹水,将腹水收集、离心后,经ProteinG-Sepharose纯化。SDS电泳分析表明(图2),该抗体已获得高度纯化。得到的目的蛋白在还原条件下(加入β-巯基乙醇)显示分别为50kD左右的重链和25kD左右的轻链。在50kD左右的重链部分显示2个条带推测是由于抗体的糖基化结果。经ELISA检测,该抗体确定为IgG1亚型。2.3抗材料的杂蛋白以8种不同鱼类的肌肉粗提物采用Westernblot对获得的单克隆抗体的特异性进行分析。先将肌肉粗提物样品以β-巯基乙醇处理,SDS化后,进行SDS分析,结果如图3A所示。鱼肉粗提物样品中除了目的蛋白小清蛋白之外,还含有多种杂蛋白。但以抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体A4-C1进行Westernblot分析(图3B)显示,该抗体仅识别分子量在10～13kD的目的蛋白,表明A4-C1的特异性良好。该结果也显示了A4-C1与其它国内消费量很大的淡水鱼,包括鲤鱼、鲫鱼、草鱼、罗非鱼等(图3A,泳道2～5)的小清蛋白存在广泛的免疫交叉反应性。A4-C1与海水鱼蓝圆■的小清蛋白也存在较强的免疫交叉反应性(图3B,泳道6),但与鲑鱼和鳕鱼小清蛋白的免疫交叉反应性很弱(图3B,泳道7、8),这一方面可能是由于这2种鱼类的小清蛋白含量较低,另一方面,可能是由于A4-C1的识别位点在这2种鱼类中同源性较低。2.4抗pv的结合位点采用ELISA法对制备的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体(A4-C1)和商品化抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)的结合位点的重叠情况进行分析。通过相似性系数(additivityindex,A.I.)进行计算,公式为A.I.=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100。其中,A1为A4-C1反应后在450nm的吸光值,A2为PARV-19反应后在450nm的吸光值,A1+2为同时加入这2种抗体反应后在450nm的吸光值。如果二者的抗原结合位点相同或几乎重叠,A.I.的值就接近于零;如果这2种抗体的结合位点不同,则A.I.值就很大,二者空间位阻越小,A.I.值就越接近100。图4显示了ELISA法的分析结果。A.I.值计算为25%,表明抗小清蛋白单克隆抗体A4-C1和PARV-19的结合位点或者具有很大部分的重叠,或者存在较大的空间位阻效应,因此,这2种抗PV单克隆抗体不适合用于配对建立三明治夹心检测方法。同时,由于PARV-19是针对蛙而不是鱼类小清蛋白制备的抗体,该结果也从另一角度证实了A4-C1与PV的特异性结合反应。3抗咸鱼小清蛋白的纯化鱼类是最容易引起过敏的八大类食物之一,其引发过敏反应的阈值很低。因此,建立准确、灵敏的鱼类过敏原检测方法对于保证鱼类过敏患者的食用安全非常必要。目前,以核酸或蛋白质为检测对象的多种食物过敏原检测试剂盒已经问世,如花生、牛奶、大豆、鸡蛋、甲壳类动物、软体动物等。但对鱼类过敏原检测分析的报道仍较为缺乏。Heffron等采用SDS分析了大西洋魟(Dasyatissabina)小清蛋白的含量。Gajewski等制备了抗鲶鱼小清蛋白单克隆抗体。Faste等制备了抗鳕鱼小清蛋白多克隆抗体,同时建立双抗夹心ELISA法检测鱼肉中小清蛋白的存在情况,但该方法对其他鱼类尤其是淡水鱼小清蛋白的检测结果并不理想。本实验研究的对象鲢鱼属于鲤形目、鲤科。鲤科是鱼类中最大的一科,包括了约2000多种淡水鱼类,如鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼等“四大家鱼”,以及其它淡水鱼如鲤鱼、鲫鱼等。由于鲢鱼与常见的经济淡水鱼类存在较近的亲缘关系,以鲢鱼小清蛋白为抗原,进行单克隆抗体的制备,将有利于该单克隆抗体对淡水鱼类小清蛋白的检测。本研究通过盐析结合离子交换、凝胶过滤等柱层析的方法获得大量纯化的鲢鱼小清蛋白,纯化效率高。将