青蒿琥酯和雷帕霉素对类风湿性关节炎的缓解作用

青蒿琥酯和雷帕霉素对类风湿性关节炎的缓解作用

蠕虫炎是一种慢性、进展性和系统性疾病，主要是滑膜炎，其早期症状是滑膜炎，最终导致关节软骨和骨骼的损伤，导致关节变形和运动的受限。滑膜炎的出现与滑膜细胞增生和血管痉挛有关。它的机制是分泌大量激素，并释放各种基本金属酶。虽然ra的病因尚不清楚，但在过去60年中，使用缓解症状的抗生素药物（mdark）治疗后，ra的治疗效果明显，副作用明显，无法治愈。随着英伟单抗（infelticiab）和阿达穆单银（adalimmab）等肿瘤坏死因素的uf061（tnfuf061）单克隆抗体得到认可，大多数接受治疗的ra患者的病情有所改善，关节损伤程度也有所减轻。然而，根据临床数据，tnf061单一抗抗剂的有效治疗效果非常差。同时，tnf061失去了活力，干扰了身体的正常免疫防御功能，增加了患者受到病原体感染的风险。此外，tnf061的有效治疗不能修复关节和愈合损伤。因此，为了为不接受tnf61抗炎剂的患者提供更多的治疗方法，有必要开发基于发病机制的ra治疗药物。由于RA初期的滑膜血管新生和细胞增殖类似于肿瘤的部分特征,因此预期细胞凋亡诱导剂对阻止滑膜增生有效.Hultqvist等人用活性氧(ROS)诱导剂植醇治疗佐剂诱导的关节炎大鼠,结果发现ROS发生增强,自身免疫应答减弱,可同时改善关节炎的急性期及慢性期症状.同样,考虑到青蒿琥酯能诱导肿瘤细胞凋亡[5~7],有理由将其用作抗RA药物.Xu等人发现,青蒿琥酯可通过阻断NF-uf06bB和P13激酶/Akt信号通路抑制RA患者纤维母细胞样滑膜细胞增殖.He等人也证明青蒿琥酯能下调与血管形成有关的缺氧诱导因子-1uf061(HIF-1uf061)和血管内皮生长因子(VEGF)表达.另一种青蒿素衍生物SM905被Wang等人证实能通过阻遏炎症反应及Th17应答使DBA/1小鼠关节炎明显好转.上述结果表明,青蒿琥酯不仅能通过诱导细胞凋亡抑制滑膜炎发作,而且还能以非细胞凋亡方式发挥其抗炎作用.另一方面,哺乳类雷帕霉素靶点(mTOR)在多种癌症中均被发现活性上调[11~13],而mTOR抑制剂雷帕霉素(sirolimus或everolimus)可用于晚期视网膜细胞瘤、难治性套细胞淋巴瘤、进展性晚期神经内分泌瘤治疗[14~16].由此推测,雷帕霉素对关节炎也应当有效.Glantschnig等人发现,sirolimus在离体条件下能防止关节骨骼消融,其机理是抑制破骨细胞中S6蛋白、S6激酶和4E-BP1的磷酸化.Kneissel等人报道,通过抑制cathepsinK表达及成骨细胞活性,everolimus可阻断卵巢切除术诱导的大鼠关节骨骼成分丢失.Laragione等人发现,雷帕霉素通过降低mTOR及其底物p70S6K1和4EBP的磷酸化,可减少降植烷诱导关节炎中纤维母细胞样滑膜细胞对关节软骨及骨骼的侵蚀.Cejka等人也报道,在患有慢性炎症性及破坏性关节炎的转人TNFuf061基因小鼠中,sirolimus或everolimus可下调消化酶类表达及促进破骨细胞凋亡,借此减少滑膜破骨细胞形成,并保护关节避免骨骼侵蚀和软骨损失.尽管Nagy曾推测一氧化氮(NO)可能是RA的关键致病因素,但迄今对于NO如何诱导RA仍然一无所知,而且以往阐述的青蒿琥酯及雷帕霉素治疗机理从未涉及对NO的抑制作用.为了探讨RA的发病原因并阐明青蒿琥酯和雷帕霉素的抗RA机理,本研究通过小鼠关节内注射完全弗氏佐剂(CFA)建立了完全模拟胶原诱导关节炎(CIA)的CFA诱导急性关节炎(CIAA)模型,并利用此模型初步验证“NO爆发性缺氧诱导关节滑膜炎”的假说,由此证实NO在实验性RA造模中的关键作用.本研究得出的有关青蒿琥酯和雷帕霉素抗关节滑膜炎的实验动物活体药理评价结果,将为未来进一步开展新的非抗体类RA治疗药物的临床试验打下良好的基础.1材料和方法1.1cea模型的建立SPF级昆明小鼠(7~8周龄,雌雄各半,体重20~22g)由广州中医药大学实验动物中心提供,动物实验方案经广州中医药大学实验动物伦理委员会审查批准(许可证编号:SPF-2011C007).在CIA模型制备中,将胶原Ⅱ(CⅡ,购自Sigma-Aldrich)溶于0.1mol/L乙酸中.在CⅡ溶液中加入等体积CFA(Sigma-Aldrich)溶液乳化.取CⅡ-CFA乳化液于小鼠尾基部皮下多点注射,并在初次免疫后3周用相同CⅡ-CFA混合液加强免疫1次.为建立CIAA模型,将CFA溶液(2mg/mL)直接注射于小鼠后腿单侧踝关节腔内.炎症程度分级采用0~4分制:0=正常;1=一趾或多趾红肿;2=自踝关节至中爪(跗骨)发红并中度肿胀;3=自踝关节至中跗骨关节发红并重度肿胀;4=踝、爪、趾全部红肿,关节变形和僵硬.1.2双蒸水注射注射用硝普钠(SNP)粉剂(北京双鹤现代医药技术有限公司)、NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)(碧云天生物技术研究所)均溶于无菌双蒸水中,并过滤除菌,用于踝关节腔内注射给药;青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司)用5%碳酸氢钠配制,过滤除菌,现配现用,为肌肉注射给药.雷帕霉素(LCLaboratories)用无水乙醇配制,为肌肉注射给药.1.3血清no、la、spo2值的测定血清NO(NO3-/NO2-)含量及LA含量测定均使用国产试剂盒(南京建成生物工程研究所),并按厂家提供的说明书操作.将全血与生理盐水等体积混合,于8000r/min离心10min,反应完毕后,在550nm波长处测定反应液的光吸收值(A550),根据下式计算血清NO浓度:NO(uf06dmol/L)=(A550测定管-A550空白管/A550标准管-A550空白管)×C标准管(20uf06dmol/L)×稀释倍数.将全血与0.6mL蛋白质沉淀剂混合,于4000r/min离心8min,反应完毕后,在530nm波长处测定反应液的光吸收值(A530),由下式计算血清LA浓度:LA(mmol/L)=(A530测定管-A530空白管/A530标准管-A530空白管)×C标准管(3mmol/L)×稀释倍数.采用国产便携式血氧仪(北京超思电子有限公司)测定关节部位的SpO2值,将待测小鼠单腿置于测定槽,将膝关节对准光线射出孔,记录LED屏上显示的读数,即为SpO2(%).1.4半定量分析将福尔马林固定和石蜡包埋关节组织(含滑膜及软骨)切成3uf06dm薄片,用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、蒸馏水洗涤.经苏木精染色后,用1%酸性乙醇分化、1%氨水返蓝、95%乙醇冲洗.伊红染色后,经梯度乙醇脱水和二甲苯清洗,用含二甲苯的封片液封片.在装备照相机的显微镜下,采用非数值计分系统对组化染色切片进行半定量分析:0,+,++,+++,++++分别表示正常、滑膜增生、滑膜下组织纤维化、淋巴浸润、关节损伤.将石蜡切片与3%H2O2在室温下共育,以抑制内源性过氧化物酶,然后用煮沸的柠檬酸修片.经磷酸缓冲液(PBS)洗涤后,用2%牛血清白蛋白(BSA)封片,再与1:100稀释的一抗在37℃下保温1h.将玻片用PBS洗涤后,与生物素化二抗在37℃下保温20min,再用PBS洗涤,与二氨基联苯胺(DAB)保温1~5min.先用自来水冲洗,再用苏木精复染.经脱水、清洗和封片后,用配置OLYMUPUSBX-51数码相机的MIAS显微图像分析系统(北京炳洋)进行免疫组化分析,由下式计算结果:免疫组化强度=阳性目标总面积/统计场总面积(面密度)×阳性目标的阳性单位(PU).1.5pcr芯片分析炎症相关细胞因子抗体芯片分析及缺氧响应基因PCR芯片分析由上海康成生物工程有限公司协作完成.抗体芯片分析采用RayBio®MouseCytokineAntibodyArray试剂盒,步骤包括:蛋白质抽提、蛋白质定量、细胞因子检测(封闭和孵育、检测、图像和数据采集).PCR芯片分析采用RT2ProfilerTMPCRArrayMouseHypoxiaSignalingPathway试剂盒,步骤包括:RNA抽提、DNA酶Ⅰ消化、RNA纯化、RNA质量检测、cDNA合成、实时定量PCR、数据分析.1.6测试结果及统计学分析除非特别指明,用于统计学分析的数据均来自实验分组(n=3)内测定结果的均值±标准差抗体芯片及PCR芯片数据仅为单个样品的分析结果.全部数据的统计学差异采用SPSS10.0(Windows版)软件进行分析.2结果2.1csa和csa在小鼠关节内注射c-fps、c、f、f-b模型中的表达经肌内注射CⅡ-CFA建立的经典CIA小鼠模型,其炎症表型是腿部、足部和脚趾出现肉眼可辨的红肿现象(图1A),在组织病理学图谱上可见明显的滑膜细胞增生和淋巴细胞浸润(图1B).相应地,经关节内注射CⅡ-CFA或CFA建立的CIAA模型也显示出与CIA模型相类似的形态学和组织学损伤(图1C~F).从图中可以看出,经CⅡ-CFA或CFA注射后,踝关节部位的肿胀程度较明显,单爪的炎症计分可达3分(整个腿部重度红肿),而且其组织损伤程度也已达到+++级(滑膜增生和炎性浸润).经典的CIA模型是将CⅡ-CFA点状注射于小鼠尾根部,造模时间长达28天.利用关节内注射CⅡ-CFA或CFA进行造模只需3天,令造模时间大大缩短.同时,大规模CⅡ-CFA造模组(n=15)或CFA造模组(n=15)的造模成功率高达100%,表明本研究建立的CIAA造模方法代表了目前最快捷、最有效的小鼠早期RA造模方法之一.为阐明关节发炎与免疫激活的相关性,在CFA免疫前后分别对血清中的细胞因子进行了抗体芯片分析(表1).结果显示,CIAA小鼠与对照小鼠相比,在所测定的全部40种细胞因子中,共有31种细胞因子上调,其中几种关键的促炎症细胞因子均显著上调,包括IL-6(2.78倍),MIP-1uf061(2.59倍),TNFuf061(2.24倍),GM-CSF(1.92倍),GCSF(1.76倍),INFuf067(1.5倍),IL-1uf062(1.46倍),MCSF(1.39倍).以上结果表明,小鼠关节内注射CFA可以广泛激活促炎症细胞因子,进而开启后续炎症应答事件.因此,CFA诱导关节炎的第一步是全身性免疫激活.2.2fps性免疫反应对pahss-rendth小鼠血清no、spo2、spo2水平的影响为阐明免疫激发与组织供氧的关系及其NO在其中所起的作用,对血清中的NO及关节部位的SpO2进行了连续跟踪测定.结果显示,在关节内注射CFA之后的第一天即可测到NO释放入血,第二天出现NO剧烈爆发而形成NO峰,第三天NO峰值开始下降.CIAA小鼠与对照小鼠血清NO水平的最大差异接近2倍(图2A).相应地,在CFA注射后还可同步出现SpO2的下降,对照小鼠中SpO2的最大值高于80%,而CIAA小鼠中SpO2的最小值低于60%(图2B).由此可见,NO升高可导致SpO2下降,暗示NO与SpO2呈反相关.换言之,CIAA造模过程中CFA免疫激发产生的NO可能直接导致关节部位供氧不足及滑膜组织缺氧.2.3不同免疫组化对血管la对CIAA小鼠滑膜组织中的HIF-1uf061和VEGF进行了免疫组化定量测定.结果显示,HIF-1uf061和VEGF均在CFA免疫后出现不同程度的上调,HIF-1uf061比VEGF的免疫组化染色强度更高(图3A和B).在滑膜组织中,还可清晰地见到血管新生现象(图3C).这一结果表明,CFA免疫激发的NO通过诱导滑膜缺氧可上调HIF-1uf061和VEGF表达,而HIF-1uf061与VEGF的激活即可启动滑膜组织的血管新生过程.作为重要的缺氧指标之一,血清LA水平也在CFA注射的第一天起出现轻微升高,随后不断下降(图3D).由此推测,因NO爆发性缺氧引起的无氧代谢致使LA出现短暂升高,由此诱导HIF-1uf061和VEGF表达及新生血管大量形成.随着新血管的形成及供氧状况的改善,无氧代谢活动受到抑制,于是血清LA水平随之持续下降.2.4no在关节滑膜炎中的应用为进一步确认NO就是关节滑膜炎的启动因素,利用NO供体化合物SNP注射小鼠关节腔,并在连续注射3天后观察关节肿胀情况,并与关节内注射CⅡ-CFA及SNP+CⅡ-CFA的小鼠进行比较.结果显示,SNP能模拟CIAA小鼠的关节炎症表型,单爪的炎症程度可计2分,比2mg/mL及200uf06dg/mLCⅡ-CFA处理诱导的炎症(计3分)稍低,但高于20uf06dg/mLCⅡ-CFA处理诱导的炎症(仅计1分).在相同浓度下,SNP+CⅡ-CFA合并处理与CⅡ-CFA单独处理的炎症计分无明显差异,可能原因是SNP+CⅡ-CFA与CⅡ-CFA的注射量均为200uf06dL,合用时CⅡ-CFA浓度已减半(图4).以上结果显示,无论NO的来源如何,它都扮演着启动关节滑膜炎的关键角色.为从反面证实NO在关节滑膜炎中的启动作用,用NO合成抑制剂L-NMMA与CFA联合注射后,观察了小鼠关节部位的肿胀情况.结果表明,不同剂量及不同部位(左后腿或右后腿)注射CFA均可引起关节肿胀,而且炎症程度较高(计3分)(图5A~C).若注射CFA又同时注射L-NMMA,则不出现明显的关节肿胀(图5D和E).但是,在两条后腿的踝关节腔内均注射CFA,而仅在一条后腿的踝关节腔内注射L-NMMA,还是会在两条后腿上出现关节肿胀,只不过注射L-NMMA者肿胀较轻微(图5F).对各小鼠关节部位的SpO2测定结果表明,CFA注射后关节部位对应于较低的SpO2值,而CFA+L-NMMA注射后关节部位对应于较高的SpO2值(表2),表明L-NMMA可以通过抑制NO合成而改善关节部位的供氧状况,从而缓解关节滑膜炎症状.2.5血清炎症基因表达水平滑膜细胞缺氧信号基因表达PCR芯片分析表明,CⅡ-CFA及CⅡ-CFA+SNP均能上调NOS2基因表达(2~4倍),而SNP下调NOS2基因表达(3倍),表明SNP释放的NO对NOS2基因有阻遏作用.同时,无论CⅡ-CFA诱导产生的内源NO或SNP释放的外源NO,均能上调免疫应答基因的表达,这些基因包括IL-1a,IL-6,NOTCH1基因等(表3).这些结果与前述CⅡ-CFA注射上调促炎症细胞因子表达的抗体芯片分析结果相吻合.由上表还可见,缺氧响应基因(ANGPTL4,ARNT2,CREBBP,EP300,HIF-1a,MT3,PRKAA1)、氧化应激响应基因(CAT,CYGB,GPX1)及其他与应激响应有关的基因(ADM,EPO,HYOU1,VEGF)等的诱导表达水平偏低,表明这些基因的表达在SNP注射后3天内尚未出现明显升高.另外,快骨骼肌可磷酸化肌球蛋白轻链基因(Mylpf)分别被SNP,CII-CFA,SNP+CⅡ-CFA下调1000,50和15倍,其生理意义暂不明确.为阐明SNP,CⅡ-CFA,CFA单用或联用对缺氧响应基因表达在较长时间内的调控作用,利用不同浓度的SNP,CⅡ-CFA,SNP+CⅡ-CFA,CFA,SNP+CFA注射小鼠背部皮下组织,并在12天后对HIF-1uf061和VEGF进行免疫组化分析.测定结果表明,随着SNP浓度逐渐增加,HIF-1uf061和VEGF表达水平不断升高,其中以100uf06dg/mLSNP处理的表达水平最高,HIF-1uf061约为对照的7倍,而VEGF约为对照的4倍(表4).由上表还可看出,SNP,CⅡ-CFA,CFA单用都能上调HIF-1uf061和VEGF表达,但联用并未在单用的基础上提高HIF-1uf061和VEGF的表达水平,这可能是因为联用时SNP使用浓度(100uf06dg/mL)低于单用时浓度(50uf06dg/mL)的缘故.2.6青蒿表现对减少前注射限制后小鼠血清no水平的影响在CFA免疫前4h,于小鼠皮下注射青蒿琥酯或雷帕霉素,并在CFA免疫后继续注射(每天2次,连续注射3天),然后分析青蒿琥酯或雷帕霉素对CIAA造模过程中促炎症细胞因子表达的影响.结果表明,仅雷帕霉素对CFA诱导的免疫激活具有较强的抑制作用,而青蒿琥酯并未对CFA的诱导表现出明显的免疫抑制效应(表5).雷帕霉素使INFuf067,IL-1uf061和IL-6等促炎症细胞因子的表达水平分别下降至CFA免疫小鼠的70%,85%和82%,而青蒿琥酯则使上述促炎症细胞因子的表达水平略有升高,分别为CFA免疫小鼠的1.46,1.41和1.79倍.由上表还可看出,经青蒿琥酯或雷帕霉素注射的CIAA小鼠,其TNFuf061及可溶性TNFuf061受体(sTNFRⅠ,sTNFRⅡ)的表达水平均比未注射药物的CIAA小鼠稍高(1~2倍),这说明青蒿琥酯或雷帕霉素对TNFuf061及其受体表达无抑制作用.将小鼠CIAA模型的治疗分成造模前给药组(CFA免疫前4h开始注射,每天注射2次,连续注射3天)和造模后给药组(CFA免疫后开始注射,每天注射2次,连续注射5天),观察青蒿琥酯或雷帕霉素对血清NO水平的调节作用.在前处理组中,经青蒿琥酯或雷帕霉素注射3天后,其血清NO水平下降到与对照相当的水平;在后处理组中,经青蒿琥酯或雷帕霉素注射5天后,其血清NO水平与对照水平相当或低于对照(图6A).与未处理CIAA小鼠相比,无论前处理或后处理都能使SpO2升高,但青蒿琥酯后处理组并未恢复到正常的SpO2水平(图6B).这些结果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素都能通过抑制NO的合成而部分缓解CFA诱导的缺氧现象,但前处理的效果比后处理好.2.7青蒿表现对fpse-la和vegf表达的影响在CFA免疫小鼠中,青蒿琥酯或雷帕霉素前处理3天以及青蒿琥酯后处理5天,均可逆转HIF-1uf061表达上调,但雷帕霉素后处理5天的效果较差(图7A).雷帕霉素前处理的HIF-1uf061表达水平与对照相当,而雷帕霉素后处理的HIF-1uf061表达水平为对照的2倍.青蒿琥酯或雷帕霉素处理使血管再生过程受阻,使CFA免疫导致的LA含量增加显著(图7B).无论前处理或后处理,青蒿琥酯或雷帕霉素都能促进无氧代谢活动的增强,其中雷帕霉素处理的LA含量比青蒿琥酯处理的LA含量更高,甚至高于CFA处理.以上结果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素可抑制CFA诱导的HIF-1uf061和VEGF表达上调,前处理的效果比后处理好.但是,由于血管增生受到抑制,青蒿琥酯或雷帕霉素均不能阻止血清LA水平的升高.2.8青蒿表现在造模前后和联合给药前后的质量比较见表1.在造模前给药组中,经青蒿琥酯处理后,CIAA小鼠的腿部仍有肿胀(图8A);经雷帕霉素处理后,CIAA小鼠的腿部肿胀减轻(图8B);青蒿琥酯+雷帕霉素处理的CIAA小鼠表现明显的足部红肿现象(图8C).在造模后给药组中,青蒿琥酯处理的CIAA小鼠的关节及脚趾可见明显红肿(图8D),但雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素处理可使红肿程度大为缓解(图8E和F).上述结果表明,青蒿琥酯、雷帕霉素对实验性关节滑膜炎具有不同程度的预防和治疗作用,其中雷帕霉素优于青蒿琥酯.在造模前给药组中,青蒿琥酯与雷帕霉素联合给药的效果比单用青蒿琥酯好.造模前联合给药效果不如造模后联合给药效果的原因可能是前者的雷帕霉素剂量低(30uf06dg/mL),而后者的雷帕霉素剂量高(50uf06dg/mL).2.9滑膜细胞水浸青蒿琥酯前处理的CIAA小鼠,滑膜细胞轻度增生,间质大量中性粒细胞浸润(图9A);雷帕霉素前处理的CIAA小鼠,滑膜未见明显增生,间质见中性粒细胞及淋巴细胞浸润(图9B);青蒿琥酯+雷帕霉素前处理的CIAA小鼠,滑膜细胞轻度增生成1~2层,可见散在少许慢性炎细胞浸润(图9C).青蒿琥酯后处理的CIAA小鼠,滑膜细胞增生成2层,可见散在慢性炎细胞浸润(图9D).雷帕霉素后处理的CIAA小鼠,滑膜细胞增生成2层,未见明显炎细胞浸润(图9E);青蒿琥酯+雷帕霉素后处理的CIAA小鼠,滑膜细胞未见明显增生,未见炎细胞浸润(9F).由上述结果可知,无论前处理或后处理,雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素的效果均优于青蒿琥酯,其中青蒿琥酯+雷帕霉素后处理对于阻断滑膜增生及炎性浸润具有良好作用,可能是实验性RA模型治疗的较好方案之一.3no的作用意义基于TNFuf061单抗的生物疗法已获准用于临床治疗RA患者,在一定程度上解除了RA患者的病痛.可是,仍有多达40%的患者对于TNFuf061单抗治疗无应答或不敏感,凸显出开发其他替代性治疗药物的紧迫性和必要性.为什么RA患者中存在TNFuf061单抗的无应答者呢?根据本文得出的结论,NO爆发性缺氧是启动关节滑膜血管新生和细胞增殖并导致滑膜炎乃至关节炎的关键因素,但NO既可由TNFuf061激发,也能由IL-1uf062等其他促炎症细胞因子激发.因此,仅仅抑制TNFuf061而不抑制其他促炎症细胞因子就不足以阻断炎症诱导的NO合成,这可能是TNFuf061单抗仅对部分RA患者有效的原因.由此推论,用工程肽或反义技术封闭TNF受体对保护RA患者免受关节炎症损伤的作用可能也是有限的.构建基于发病机理的RA动物模型不仅有利于筛选和评价抗RA候选药物,而且可以从另一个侧面揭示RA的真正病因.在小鼠中进行CIA造模需要含有加热灭活细菌的CFA对CⅡ诱导的免疫激活作用加以强化,而且造模所需要的时间较长(3~4周).我们尝试将CⅡ-CFA免疫由皮内注射改成关节内注射后,已将造模至滑膜炎出现的时间缩短到3天.由于已有报道称抗CⅡ反应只是RA致病的结果而非原因,因此我们尝试用CFA替代CⅡ-CFA进行造模,结果可在1~3天内诱导急性滑膜炎.这可能是迄今为止已知最快捷的小鼠RA造模方法之一,有望成为抗早期RA药物高通量筛选及高效药理评价的实验平台.关于NO在RA发作中的意义,Perkins等人报道,诱导型NO合酶(iNOS)基因敲除可赋予小鼠对骨骼消融的抗性,表明NO控制着RA发病的某个关键环节.最近,Chow等人报道,广泛用于骨关节炎治疗的透明质酸可通过抑制滑膜中iNOS活性阻断佐剂诱导关节炎大鼠的软骨及骨骼侵蚀性损伤.尽管过去曾有人提及NO在RA致病过程中的可能作用,但只注意到NO诱导免疫功能失调或NO调节线粒体活性.作为RA病因的机理性探索,我们最近首次证实了病原体感染、促炎症细胞因子上调、NO爆发、缺氧诱导、血管新生、细胞增殖和炎性浸润之间的因果关系.Ng等人在RA患者中发现,氧分压(tPO2)与滑膜炎症之间存在着直接的相关性,认为缺氧是关节发生炎症的一个可能的驱动因素.同样,本研究所观察到的免疫激发性NO与SpO2的互作也支持这一结论.那么,NO究竟是如何驱动缺氧的呢?Han等人指出,NO可通过加速进入红细胞促进其自身消耗,NO可能占据血红蛋白中的O2结合位点.滑膜原本就是一个相对缺氧的组织,其软骨中的氧分压从表层的6%到深层的1%,NO的大量积累将使滑膜的缺氧状况更趋严重.同时,NO也可跨膜进入线粒体内并结合细胞色素c氧