酵母双杂交系统的建立与应用

酵母双杂交系统的建立与应用

1989年，stanny字段s和kunukayu首次提出了这一系统，以分析葡萄酒中物质和物质的相互作用。他们是在利用酿酒酵母GAL4蛋白的特性来研究蛋白质间相互作用的过程中建立的这种全新的方法。酵母双杂交系统自建立已有15a年的历史,已经逐步发展成一个较完善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统,并基于原初的基本原理衍生了一系列类似的系统:酵母单杂交系统、反向双杂交系统、三杂交系统,还有人预测,将来还可能出现四杂交系统。自酵母双杂交系统创建以来,已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段,并揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。如今,这一研究蛋白质间相互作用及蛋白质与其他大小分子间相互作用的系统,已经比较广泛地运用到了诸如分子生物学基础研究、蛋白质组与功能基因组研究、疾病机理分析与药物筛选等多个领域中。下面就基本原理、操作程序、系统衍生、应用进展、存在问题及发展前景等方面简要地阐述。1活转录的基因酵母双杂合系统是在1989年由StanleyFields和Ok-kyuSong建立,利用的是GAL4蛋白的性质。该系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。转录激活因子在结构上是组件式的,即这些因子往往由2个或2个以上相互独立的结构域构成。GAL4蛋白是1个基因转录激活子(由它激活转录的基因可以编码半乳糖苷酶)。它包括2个分离的功能性结构域:1个能结合特异DNA序列(UASG)的N末端结构域和1个包含酸性区域的C末端结构域,它是转录激活所必需的。双杂交系统是这样建立的:GAL4的DNA结合结构域,与X蛋白质融合;GAL4的激活结构域,与蛋白质Y融合;X和Y形成一个蛋白质复合物,重新形成GAL4结构域的邻近效应,即实现了转录因子功能重建,导致UASG调控的基因(报告基因)开始转录。他们当时还用2种已知的能与SNF1和SNF4互作的酵母蛋白质检验了这个系统,只有当2个融合蛋白都出现在1个细胞中时才能获得高的转录活性。它首先主要用于研究相互作用蛋白质的初步鉴别,而不是各种相互作用的具体特征。现在拓展或衍生出的各个相关的系统都是基于这个最基本的原理的。在这以前,也有许多生物化学方法用来研究蛋白质间相互作用,但都是在体外研究,该系统可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用,且通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用的蛋白基因。2诱导蛋白构建酵母双杂交系统与其衍生系统的操作程序是类似的,其基本操作程序大体包括以下几个步骤:①选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌;②诱饵蛋白表达质粒的构建和鉴定;③诱饵蛋白自身转录活性分析;④猎物蛋白cDNA文库的构建;⑤酵母双杂交筛选与阳性克隆鉴定。这是筛选相互作用蛋白的基本步骤,如果需要利用双杂交进行其他方面的研究,可根据不同试验目的进行相应地调整。3酵母双杂交系统和细胞系统1989年由StanleyFields和Ok-kyuSong等提出并首次建立酵母双杂合系统,该系统是在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。1992年,Fearon等在CHO细胞中作了双杂交分析,他们选择的报告基因是编码细胞表面的抗原基因和抗药性基因。其原理与酵母双杂交系统相似,但技术要求更高。1993年,发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系,称为酵母单杂交系统(one-hybridsystem)。与双杂交系统不同之处在于转录激活域AD相融合的待筛选蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合,使AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需BD-X的参与,因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。该系统为转录因子的分离鉴定提供了有效的实验手段。1995年,LeDouarin等又构建了一套新的双杂交系统,用URA3基因作为报告基因,通过在培养基中添加6-氮尿嘧啶(URA3基因产物的抑制剂),可以定量测定产物乳清酸-5-单磷酸脱羧酶的活性,比LacZ基因表达在含X-gal的培养基上生长的颜色反应更为精确。1996年,Vidal等建立了反向酵母双杂交系统,为这一领域的研究提供了有效的途径:这是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术。其关键是报道基因的表达产物对细胞生长有抑制作用。这样当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时,表达出有毒性的报道蛋白,细胞不能生长。Vidal等建立的酵母细胞株中,其Ura3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制,此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中需GAL4的DNA结合结构域和转录激活结构域的融合蛋白相互作用,使URA3表达。其产物为合成尿嘧啶所必需,因此细胞能够存活。但此产物同时能催化5-氟乳清酸转化为5-氟尿嘧啶,所以在含5-氟乳清酸的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。Vidal等还设计了反向单杂交系统,他们将野生型p53与其结合位点结合,激活Ura3,产生毒性物质,使细胞死亡;当p53基因突变时,诸如R175H和R249S,则不能与其结合位点结合,使报告细胞株存活。1996年,美国威斯康辛大学SenGupta等为了研究蛋白质与RNA的相互作用设计了三杂交系统。基本原理为构建3个杂交体:其中1个杂交体是BD与1个位点特异的RNA结合蛋白融合,可结合到报告基因上;第2个杂交体是RNA(Y),含有“诱饵”顺序,且可结合到BD融合的蛋白质上;第3个杂交体是与AD融合的X蛋白。若X蛋白能与RNA结合,则AD靠近报告基因,使其激活。1997年,Aronheim等建立的SOS招募系统(SOSrecruitmentsystem,SRS)就是一个典型的代表。该系统中蛋白的相互作用发生在膜上。它通过待测蛋白的相互作用,将SOS蛋白带到细胞膜上,激活附近的RAS蛋白。从而打通RAS信号途径,使RAS途径不通的菌株得以生存。1998年,Karimova等设计了细菌双杂交系统。它利用了cAMP的正调控信号传导途径重建的原理,将2个蛋白质分别与2个功能互补片段T25和T18融合(T25和T18互补构成腺苷酸环化酶的催化功能域),2个杂交质粒在腺苷酸环化酶缺陷的大肠杆菌中可相容,若2个杂交蛋白相互作用,使T25和T18相互靠近,功能互补,导致cAMP的合成,而cAMP可触发一些cAMP/CAP依赖的启动子的活化,使报告基因转录。该系统的优点是细菌有更高的转化效率,可以分析更为复杂的文库,也可以对更大的蛋白质相互作用网络作综合性分析。近年来酵母双杂交系统也有所发展,主要朝着精确化自动化规模化方向发展,其应用领域也在不断拓展。4蛋白—主要应用研究进展酵母双杂交系统是研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术平台,随着该系统的不断完善和拓展,其应用范围已扩展到蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其他小分子间相互作用的研究,如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及其他相关分子。其应用进展主要表现在以下几个方面。4.1酵母共聚体对ipac为抑制剂的微生物耐药该系统自建立以来已经用来研究了许多种重要蛋白质间的相互作用,包括:检测蛋白质间的相互作用,确定相互作用位点,确定与已知蛋白相互作用的未知蛋白等。阎晓宇等利用酵母双杂交系统筛选到与痢疾杆菌侵袭素IpaC相互作用的真核细胞蛋白质,得到的阳性克隆中有2个编码人胶原酶蛋白片段,提示IpaC可能在胶原酶参与的生物学过程中发挥作用。PeterUetz等运用2个大规模酵母双杂交系统,鉴别从酿酒酵母基因序列中预测到的全长开放阅读框编码的蛋白质与蛋白质间的相互作用。他们运用了文库筛选和列阵筛选2种方法,前者效果较好,而后者具有高通量的特点。4.2种功能已经成功的的分子中,增加了酿酒酵母的扩增培养,筛选n该系统在蛋白质组研究上的应用可以说尚处于初级阶段,尝试较多。但已显示其在分析鉴定细胞内复杂的蛋白质相互作用方面的潜力。Fromont-Racine等在研究剪接因子与其他因子的相互作用的过程中以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作“诱饵”蛋白,从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。根据分析把从中得到的靶蛋白做成新的“诱饵”蛋白再进行筛选。经过3轮筛选后,他们从中得到约700个阳性克隆。这些筛选到的靶蛋白中,有9种是已知的mRNA前体剪接因子,5种是新发现的剪接因子,8种是与RNA其他加工过程有关的因子。由此可见,该系统不但可用来在体内检验蛋白质间的相互作用,而且还能用来发现新的作用蛋白质,从而认识蛋白质组中特定代谢途径内的蛋白质相互作用关系网络,为建立生物体的蛋白质图谱提供条件。4.3酵母细胞内信号蛋白的调节在细胞信号转导中,蛋白质间或蛋白质与其他分子间的相互作用是重要的信号传递形式。酵母双杂交系统在信号转导研究中能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节,故有重要的应用价值。选择不同的细胞代谢或信号转导途径为出发点,通过类似的双杂交实验也有可能建立酵母细胞完整的蛋白质联系图谱。BryanCBarnhart等研究认为,死亡效应器结构域蛋白质家族可以用来作为癌症治疗的靶标,因为这个蛋白质家族能通过与其他分子(包括蛋白质)的相互作用对细胞存亡信号转导进行调控。4.4hcv与ns5a自酵母双杂交系统建立以来,其在病毒学研究中的应用越来越广泛和重要。通过酵母双杂交等技术,很多病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用已被确定。丙型肝炎病毒HCV至今没有有效的病毒培养系统,还必须应用分子生物学技术克隆来进行相关研究。ShiS.T.等通过对HepG2和人肝cDNA文库的酵母双杂交筛选到apoAl—一个高密度脂蛋白成分,与NS5A相互作用,提示NS5A参与脂代谢紊乱的病理过程,可以解释HCV感染后普遍存在的肝脏脂肪变性。植物病毒学中研究的对象多是单链正义RNA病毒。宿主蛋白与病毒编码的蛋白间的互作,影响植物的生长发育。联体病毒居成员蛋白AL1起始病毒DNA复制,调节自身表达和诱导植物基因转录。用YTHS筛选和1个杆状病毒居成员蛋白互作的系统鉴定与AL1互作的植物宿主蛋白,结果显示与AL1互作的蛋白有1个丝氨酸和苏氨酸激酶,1个驱动蛋白,1个组蛋白H3,从而证明AL1也参与了植物细胞分裂和发育。4.5酵母双杂交随机肽库酵母双杂交技术突出的优点是可以用“X”蛋白作为“诱饵”,从基因文库中去筛选所有能与“X”蛋白质结合的任何“Y”蛋白质及其基因。可以利用此种技术,寻找与病毒或细菌蛋白相结合的肽段,从而设计并产生新的抗菌肽或抗毒肽。胡承香等通过将随机DNA片段与GAL4的AD融合构建酵母表达载体,而成功构建了一个可筛选、扩增的酵母双杂交随机肽库,可用于筛选和设计靶蛋白相互作用多肽(主要用于药物筛选设计)。酵母双杂交系统的筛选发生于酵母细胞内,对胞内蛋白而言,应用此系统更能保持靶蛋白的天然构象和功能,如此筛选获得的多肽具有生物活性的可能性更大。此技术已逐渐被应用于筛选新型的具有生物活性的肽类药物、诊断试剂和其他功能性多肽。现在,能抑制SrcSH2结构域并能和配体相互作用的小分子已经开发并用来治疗骨质疏松症,特别是抑制破骨细胞再吸收。但在设计这些小分子抑制剂和调节剂的过程中遇到了一个历史性挑战:这些组件式的结构域在各自家族内高度同源,难以开发一种针对一个特定相互作用的高度特异性抑制剂。FrankBecker等利用三杂交方法在蛋白质组中筛选出小分子激酶抑制剂,因为各种已知的CDK抑制剂,包括嘌呤和茚并吡唑类似物,都以基于甲氨蝶呤的杂交配体的形式在cDNA文库或基于酵母细胞列阵的筛选中展示,可以使细胞循环中的激酶的靶标被鉴别出。证明这种三杂交系统可以用来寻找药物靶标。4.6hbxag和tbp1的相互作用许多疾病的发生都与分子间的相互作用有很大关系。用酵母双杂交系统研究这些分子间的相互作用有助于阐明许多疾病发生的机理,进而为疾病治疗提供理论依据。Barak等研究了HBxAg和人免疫缺陷病毒(HIV)的Tat结合蛋白1(Tbp1)的相互作用,应用基于胞质的酵母双杂交筛选鉴定出Tbpl,一个新的与HBxAg相互作用蛋白。Tbpl在酵母和动物细胞内均和HBxAg有相互作用。HBxAg和Tbpl相互作用具有功能性意义调节HBV转录。Tbpl同源物如Sugl,是蛋白酶19S调节帽颗粒的已知成员,涉及转录共激活。Tbpl和Sugl与多重病毒效应蛋白包括HIVTat、SV40大T抗原和腺病毒E1A作用,而这些蛋白是病毒癌基因的重要表位。4.7ssc113对dna的复制特性的分析分子生物学发展非常迅速,但仍有许多基础性理论和应用问题还没有研究清楚,有关于各个相关生物大小分子间的相互作用的问题可以用酵母双杂交系统来研究。RahulSharma等研究认为,大肠杆菌宿主编码的DnaA起始因子蛋白的N末端结构域I和C末端结构域IV都与pSC101的质粒编码的RepA起始因子相互作用。在体外与DnaA相互作用的是RepA的N末端区域不是C末端区域。这些相互作用对复制起始的前两步即起始点解链和解旋酶的产生起关键作用。RepA的结构域I和IV都不能独自启动pSC101复制。然而当这两个结构域在一个共同的细胞环境中共表达并且能通过一对亮氨酸拉链非共价互作时,质粒才能在体内复制。研究结果显示:DnaA的结构域I和IV的共价或非共价物理连接和它们与RepA的相互作用,都对复制起始起关键作用。这个结果可以用来建立一个新的细菌双杂交系统。Fraldi等通过双杂交及三杂交技术发现了CycT1与CDK9及Tat/TAR特异的结合位点,这些发现提示可设计一个正确的位点缺失的P-TEFb复合物干扰Tat的功能。5蛋白质间相互作用引起的检测酵母双杂交系统由于具有敏感性、简洁性、真实性和广泛性等优点而被应用到许多方面的研究,但该系统还是有它自身的局限性的。首先,它不能用于任何蛋白质间相互作用的分析,对于筛选对象和范围,必须有一个选择,各种双杂交系统和衍生的杂交系统都有一定的适用范围。其次,假阳性的存在,即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生,必须考虑到假阳性因素(没有发生相互作用就能引起阳性反应)的排除。再次,假阴性也是存在的,主要原因是某些蛋白不