玉米幼苗根显微结构及呼吸代谢对淹水胁迫的响应

玉米幼苗根显微结构及呼吸代谢对淹水胁迫的响应

0膜过滤除氧化作用[研究意义]土壤洪水严重阻碍了植物的生长和产量，对植物的主要伤害是缺乏氧气。多数玉米品种受到渍涝伤害都易发生叶片萎蔫、变黄,根系腐烂等,但不同玉米品种根系对渍涝的反应存在较大差异,通过不同品种比较的方法,研究渍涝胁迫下玉米根显微结构及呼吸代谢差异,可以为玉米耐渍涝品种选育和利用提供理论依据。【前人研究进展】淹水使局部缺氧,不仅根系生长发育受限,根冠生长失调,同时导致根系组织细胞裂解,融生气腔产生或通气组织形成。淹水后,通气组织的形成是作物抵抗涝害的机制之一。前人做解剖学研究发现,淹水胁迫使植物细胞排列疏松,细胞间隙增大,通气组织发达。通气组织和细胞孔隙度决定了植物对淹水胁迫的忍耐能力。淹水也导致根系生理功能和体内激素平衡破坏、营养失调,根系活力下降。在无氧状况下,植物线粒体的电子传递和氧化磷酸化将会停止,三羧酸循环不能运转,只能靠发酵作用产生ATP。因此,当淹水导致氧气供应不足时,植物的根会从有氧呼吸转移到无氧呼吸模式(涉及糖酵解和发酵)。有研究表明,玉米在厌氧条件下丙酮酸脱羧酶(PDC)活性增加5—9倍,PDC的mRNA增加20倍。乳酸脱氢酶(LDH)的诱导可以维持厌氧植株的乳酸发酵过程,与乙醇发酵一起在不损失碳的情况下维持植物体内的氧化还原平衡。有研究指出厌氧条件下三叶草(Trifoliumsubterraneum)乙醇脱氢酶(ADH)活性较含氧量正常条件下的高。ADH可以缓解水稻遭受厌氧胁迫后的伤害。【本研究切入点】目前为止,淹水后,不同玉米品种的无氧呼吸酶及根系解剖结构的变化之间的比较还鲜见报道。【拟解决的关键问题】本文以耐涝性较强的品种浚单20和耐涝性较弱的品种登海662为材料,通过在苗期淹水处理后,对两品种根干重、总根长、根系活力、根系解剖结构和无氧呼吸酶活性的变化进行比较,从根形态、结构、生理3个层次,探究渍涝胁迫下不同玉米品种对渍涝胁迫的响应和适应机制。1材料和方法1.1试验设计1.1.1试验材料的评估1.1.2田间处理试验试验于2011年在河南农业大学科教园区进行。供试品种为登海662(DH662,耐涝性较差)和浚单20(XD20,耐涝性较好)。试验采用盆栽(同1.1.1)。裂区设计,主区为品种,副区为淹水处理。副区设5个处理:1、CK(不淹水);2、淹水2d;3、淹水4d;4、淹水6d;5、淹水8d。每个处理重复5次,每个重复3盆。在三叶一心期每盆留生长一致的玉米幼苗2株,将其淹水处理全部置于水中。在整个试验中,对照植株的土壤含水量保持在田间持水量的60%。在试验处理期间,定期加水以保持水面,其它施肥及防治病虫害等栽培管理参考大田生产。1.2测量设计和方法1.2.1总根长和总根长的测定取各处理生长一致的3株幼苗,测定单株各层根的长度,相加即为总根长。于105℃烘箱中杀青30min,在80℃下烘干至恒重,冷却至室温后用1/1000电子天平称取干重。1.2.2根系的活力在根系前端(从根尖开始3cm长的根段)取样,用改良TTC法测定根系活力,测定样本数同1.2.1。1.2.3材料上的材料以CK和淹水2、4、6d的XD20和DH662根毛区的根段为材料。将根段采用FAA固定液(福尔马林﹕冰醋酸﹕50%酒精混合液=5﹕5﹕90)固定,做石蜡切片,在OLYMPUSBX51显微镜下通过横切面对根细胞的显微结构进行拍照观察。1.2.4通气组织面积根孔积率是指根横切面上孔隙(包括正常细胞间隙、裂生间隙和溶生腔隙)的面积占整个根面积的百分比。将光镜下拍摄的淹水2、4、6dXD20和DH662根的横切照片,用摄像软件ImageExpress6.0自带的测量工具测量根通气组织面积。每个品种每一淹水时期的材料随机测定6个数据。1.2.5粗酶液的提取选取长3—5cm、直径1.5mm左右的生长根,称取0.5g左右,放入预冷研钵中,加入预冷的酶提取液:50mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8),内含5mmol·L-1MgCl2、5mmol·L-1-巯基乙醇、体积分数为15%甘油、lmmol·L-1EDTA、1mmol·L-1EGTA和0.1mmol·L-1苯甲基磺酰氟,冰浴研磨后,于4℃12000×g离心20min,提取粗酶液。乳酸脱氢酶(LDH):参照Mustroph等的方法,2.5mLTris-NaCl-NADH缓冲液(pH7.5),150μL酶提取液,用0.5mLTris-NaCl-丙酮酸启动反应,测定340nm波长吸光值的变化。乙醇脱氢酶(ADH):参照Mustroph等的方法,890μL50mmol·L-1TES缓冲液(pH7.5)(内含0.17mmol·L-1NADH),100μL酶提取液,用10μL乙醛启动反应,测定340nm波长吸光值的变化。丙酮酸脱羧酶(PDC):参照Mustroph等的方法,940μL50mmol·L-1MES缓冲液(pH6.8)(内含25mmol·L-1NaCl,lmmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1TPP、2mmol·L-1DTT、0.17mmol·L-1NADH、50mmol·L-1草氨酸钠、10UADH),50μL酶提取液,用10μL10mmol·L-1丙酮酸启动反应,测定340nm波长吸光值的变化。1.2.6统计分析2结果2.1洪水对不同品种玉米的根形状和生理的影响2.1.1不同品种对淤水胁迫的响应淹水胁迫下,两玉米品种的根干重明显下降(图1),且随着淹水天数的延长,根干重降低的幅度增大。如淹水2d时,两玉米品种的根干重平均比对照降低5.1%,淹水至8d时,平均比对照降低20.9%。然而不同品种对淹水胁迫的响应程度不同,淹水后登海662(DH662)根干重下降的幅度远远大于浚单20(XD20),如淹水2d时,DH662和XD20根干重分别比对照降低8.6%和1.5%。淹水至8d时,二者分别比对照降低29.7%和12.1%。表明淹水对不耐涝品种DH662根干重的抑制程度大于耐涝品种XD20。2.1.2不同玉米品种对u3000dh652总根长的变化由图2可以看出,淹水胁迫下,两玉米品种的总根长均明显下降,且随着淹水天数的延长,总根长降低的幅度增大。如淹水2d时,两玉米品种的总根长平均比对照降低12.2%,淹水至8d时,平均比对照降低38.7%。然而不同品种对淹水胁迫的响应程度不同,淹水后DH662总根长的降幅远远大于XD20,如淹水2d时,DH662和XD20总根长分别比对照降低14.7%和9.7%。淹水至8d时,二者分别比对照降低50.3%和27.0%。表明淹水对DH662总根长的抑制程度大于XD20。2.1.3双重身份对盐胁迫的响应淹水胁迫下,两玉米品种的根系活力均明显下降(图3),根系活力与根长度和根干重的变化趋势一致。淹水2d时,两玉米品种的根系活力平均比对照降低6.7%,淹水至8d时,平均比对照降低19.7%。但两品种以DH662对淹水胁迫的响应更为敏感,表现出其根系活力下降的幅度远大于XD20,如淹水2d时,DH662比对照降低9.7%,而XD20仅降低3.6%;淹水至8d时,二者分别比对照降低30.6%和8.7%,可见淹水胁迫时间越长,对DH662根系活力的抑制程度越大。2.2洪水对不同品种玉米的根结构的影响2.2.1细胞级生长和气腔形成从图(图4-A和4-E)中可以看出,正常未淹水时,玉米根系皮层细胞之间连接紧密,细胞间隙很少。淹水处理2d后,两玉米品种根皮层中都有因细胞之间发生分离而成的一些细长缝隙,但是并没有溶生性气腔形成,XD20中部皮层一些细胞发生膨大(图4-B,箭头示),而DH662没有细胞明显膨大的迹象(图4-F)。淹水4d后,XD20有多个形状不规则的溶生性气腔形成,细胞裂生间隙更多、更大,整个皮层的结构变得松散(图4-C,箭头示)。DH662也有气腔形成,裂生间隙增多、变大(图4-G,箭头示)。在淹水6d后,XD20根中有很多气腔形成多个细胞发生溶合形成一个大的气腔,相邻气腔的细胞壁叠在一起形成双层壁(图4-D,箭头示),这些气腔呈辐射状排列,根结构仍保持完整;而DH662皮层有几个大的气腔形成,但是有的气腔细胞壁发生断裂,相邻气腔贯通;皮层和中柱之间发生了分离,中柱有部分细胞发生破裂,呈崩溃状(图4-H,箭头示)。2.2.2膜胁迫对通气组织面积的影响淹水胁迫下,玉米根系内部产生明显的通气组织,且玉米根通气组织面积随淹水胁迫的延长均呈增加趋势,增幅因品种而异(图5)。淹水4d时,XD20和DH662根通气组织面积分别是对照的3.97倍和1.85倍,差异达显著水平。淹水胁迫至6d时,根通气组织面积分别是对照的5.74倍(XD20)和2.10倍(DH662),淹水显著增加了XD20根通气组织的面积。由图6可见,淹水胁迫显著增加了玉米的根孔积率。淹水2d后,XD20根孔积率增加到对照的2.96倍,淹水4d后,根孔积率增加到对照的2.92倍,淹水6d时增幅最大,为对照的3.7倍。而DH662增幅小于XD20,在淹水2d、4d和6d时根孔积率分别比对照增加25.3%、65.3%和89.6%。2.3dh、adh和pdc活性的变化由图7、8、9可以看出,淹水处理使玉米根系LDH、ADH和PDC活性增加,增加程度因品种而异。淹水2d时,DH662根中LDH、ADH和PDC活性未显著增加。淹水4d时,LDH、ADH和PDC活性显著增加,LDH和ADH活性分别增加到对照的7.1倍和2.1倍,到淹水6d时达到最大,分别增加到对照的7.2倍和3.1倍,之后两种酶活性急剧下降。DH662根系PDC活性在淹水4d时达到最大,为对照的2.2倍,随后酶活性下降(图9)。而XD20根中LDH、ADH和PDC的活性均在淹水2d时已达到最高峰,分别是对照的3.1、1.8和2.1倍,差异达显著水平。表明淹水对DH662根中LDH、ADH和PDC活性的影响程度大于XD20,其中受淹水影响最大的酶是LDH。3不耐涝品种的抗氧化酶系统对不同生长特性的影响研究表明,植物遭受淹水胁迫后会产生适应性自我调节,从形态和生理上对淹水胁迫产生一定的适应性,如(1)茎伸长生长,茎基部有不定根生成,这些不定根中有大量气腔形成,并且可以伸到水面,以吸收更多的氧气;(2)代谢途径的改变,淹水植物会通过一定的厌氧代谢获得维持生命的能量;(3)通过体内赤霉素、乙烯和脱落酸等激素含量的变化来调节植物的形态、解剖或生理活动等方面的变化;(4)抗氧化酶系统清除植株体内有毒的活性氧自由基。这些变化可以维持植物在淹水逆境下的生存能力。而不同植物、同一植物的不同品种对淹水胁迫的适应性反应存在显著差异。本试验中,淹水胁迫后,不耐涝品种DH662的根干重、总根长及根系活力的下降幅度远大于耐涝品种XD20,且随着淹水时间的延长,下降幅度更大,说明DH662对淹水胁迫的适应性调节能力比XD20弱,因此对淹水胁迫更敏感,淹水胁迫下根系生长受到的抑制更大,耐涝品种XD20适应性调节能力较强,因此,比不耐涝品种DH662能更有效地抵御淹水环境胁迫。在淹水条件下通气组织的发达程度与品种的耐涝性密切相关。不耐涝品种DH662在淹水6d后,产生通气组织虽能暂时缓解根际的低氧环境,但由于其通气组织易彼此贯通而形成一个围绕中柱的大圆环,造成皮层与中柱脱落,根结构失去完整性,达到崩溃状态,加速了根内氧气的扩散损失,因此DH662抗涝的能力明显较差。而耐涝品种XD20在淹水期间,根系通气状况良好,而且在淹水6d后根中通气组织发达,淹水6d后根孔积率达到32.7%,且结构保持完整,不仅在淹水期间有利于氧气向根际的扩散,同时良好的中柱结构抑制了氧气的根外扩散损失,因此可以缓解玉米自身的受害程度,而对根本身的结构破坏又较少,是一种对水分逆境的适应;因而从细胞学基础上进一步说明XD20耐涝能力大于DH662。淹水胁迫下由于供氧不足或缺氧会引起植株体内酒精发酵产生乙醇的毒害作用,导致有毒代谢物的积累、氰苷的水解引发细胞质内的酸毒症。缺氧使细胞内能荷急剧下降,影响了植物体内许多重要的代谢过程。低氧环境中的植物根系需要糖酵解提供能量,诱导产生了许多参与无氧呼吸的酶,包括PDC、ADH和LDH等,3种酶活的适度诱导可以维持厌氧植株的乳酸发酵过程,与乙醇发酵一起在不损失碳的情况下维持植物体内的氧化还原平衡,3种酶在防止其对植物的毒害作用方面起到了重要的作用。本试验中不耐涝品种DH662中这3种酶活性比耐涝品种XD20显著增加,而XD20根系中3种酶活性增加适度,说明缺氧对不耐涝品种DH662的伤害大于对耐涝品种XD20的伤害,XD20比DH662更能在根系维持一个有氧环境。发酵代谢产物(乳酸和乙醇)积累的过多会扰乱细胞正常代谢。细胞质酸中毒是细胞停止生长的主要原因,最后会引起细胞死亡。另外,乙醇也会对受到淹水胁迫的植物细胞造成额外的伤害。因此,不耐涝品种DH662的相当高水平的发酵代谢途径可能会引起更深的代谢副产物毒害,这可能是DH662会很快呈现衰老症状的原因。至淹水8d时,不耐涝品种DH662中ADH、LDH、PDC酶活性的显著下降可能是因为有毒代谢产物的积累使植株的生长发育失调。有毒的副产物乳酸或乙醇的含量多少对玉米植株生存的影响程度需要做进一步的研究。由于渍涝灾害给农作物的生长带来了巨大的危