不同碳源对好氧反硝化细菌的脱氮性能

不同碳源对好氧反硝化细菌的脱氮性能

1菌株生物活性成分随着水体中氮素污染日益严重，氮脱氮已成为当前水处理研究的重要课题之一。现在，生物脱氮是去除废水中氮污染的最经济有效方法之一（孙金毅，2003）。反硝化是亚硝酸盐或亚硝酸盐作为气氮转化的生物过程。这一过程的重要性在于，在呼吸过程中产生了feli氨，并将氧化氮作为电子呼吸链的电子受体。作为一个电子呼吸链的电子受体，它是通过呼吸过程产生的。然而，近年来，反硝化被认为是不可能的。一些好氧反硝化的细菌（周敦贤，2004；马放，2005）。利用该方法，周丹贤等人首次提出了高效反硝化抗硝化固醇提取和筛选方法（周丹贤，2004；马放等人，2005）。利用该方法，在国外筛选出了抗硝化抗硝化菌（周丹贤，2004；马放等，2005）。利用该方法，对氨甲环酸下的反应规律进行了验证，并对氨甲环酸下的反应规律进行了验证（周丹贤，2004；马放等，2005）。周敦贤等人率先提出了抗硝化抗硝化抗硝化抗硝化菌的六株好阳性抗硝化菌进行了评价和过滤（周敦贤，2004；马放等，2005）。利用该方法，对氨甲环酸和硝基氮的去除率进行了验证，并对其生态影响因素进行了探讨（马页，2006）。对于好氧反硝化菌，碳源和c-c1n也是一个非常重要的速度限制参数。在植物生长过程中，有机物质被用作植物的重要原料，如反硝化过程中所需的能源。因此，在还原过程中，有机碳源可以利用电子供体和亚硝酸盐氮作为电子受体将亚硝酸盐转化为氮，同时达到反硝化反应的效果。因此，碳源对于生物反硝化过程中的细菌生长发育、呼吸和反硝化，反硝化是生物反硝化过程中不可或缺的一部分。在反硝化过程中，我们必须利用低生长量（即低细胞产量）的有机物质作为碳源，并同时达到抗硝化反应的效果。结果表明，碳。本文针对好氧反硝化菌株X31,考察不同碳源和碳氮比对X31菌株的好氧反硝化性能的影响,以期为好氧反硝化细菌应用于工程实践提供基础资料.2试验材料和方法杏仁2.1试验中的蘑菇供试菌株:X31,来源于哈尔滨工业大学黑龙江省环境生物技术重点实验室,经鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.).2.2微量元素检测反硝化培养基DM成分(Robertsonetal.,1992):Na2HPO4·7H2O7.9g·L-1;KH2PO41.5g·L-1;NH4Cl0.3g·L-1;MgSO4·7H2O0.1g·L-1;微量元素溶液2mL;pH7.0～7.5;碳源和KNO3根据试验要求进行调整.微量元素溶液成分:EDTA50.0g·L-1;ZnSO42.2g·L-1;CaCl25.5g·L-1;MnCl2·4H2O5.06g·L-1;FeSO4·7H2O5.0g·L-1;(NH4)6Mo7O2.4H2O1.1g·L-1;CuSO4·5H2O1.57g·L-1;CoCl2·6H2O1.61g·L-1;pH=7.0.2.3无氮氧生物反应器do设计试验装置由2L具塞密闭的试剂瓶及管件组成(见图1),整个反应器是密闭的,进出口两端配有孔径为0.25μm的滤菌器.在反应器中装入1LDM培养基后密封,与氧气罐连接,打开进气口和排气口,以3L·min-1的流量通入纯氧气3min,驱走反应器和管路内的空气,以尽量避免空气中所含氮气对测量结果的干扰.关闭排气口,通入氩气,通过气体压力表的读数确定反应器内压力为正压时,停止通入氩气,然后关闭进气口.与此同时,打开磁力搅拌器(目的是使培养液均质并与上部氧气充分接触),培养过程中溶解氧(DO)一般维持在8～10mg·L-1.通入氩气的目的是制造有压条件:一是使反应器内形成正压,使氧能够更充分地溶解到培养液中,确保绝对好氧;二是正压能够阻止空气中的氮气进入反应器.温控仪用以控制反应器外部水浴温度,通过反应器内磁力搅拌子搅拌传热,使培养液温度与水浴温度相同.取样口1用于取气体样,来监测培养过程中氮气生成量,取样口2用以取培养液样品,用来监测培养过程中pH值和DO的变化以及用于菌体生物量的测定,样品经离心后取其上清液监测NO-3-N、NO-2-N和TN的变化.2.4gc/ms测定NO-2-N:用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定;NO-3-N:用麝香草酚分光光度法测定;TN:用碱性过硫酸钾法消解紫外分光光度法测定;氮气(N2):用AgilentHP4890D型气相色谱仪测定,气相色谱的色谱柱编号GS-03-106型,条件为:载气流量He20mL·min-1,柱前压0.08MPa,柱温60℃,检测器温度120℃,气化室温度120℃;溶解氧(DO)用YSI5000型DO测定仪测定;生物量(菌体干重)的测定:取发酵液5mL,在5000～6000r·min-1条件下离心10min-1,去除上清液,用磷酸缓冲液洗涤2次后于105℃下烘至恒重.3试验结果结果3.1不同碳源对菌体生长的影响本试验考察了利用丁二酸钠、乙酸钠和苹果酸钠3种不同碳源时,X31菌株的生长情况和不同碳源对其好氧反硝化能力的影响.试验开始时3种碳源在DM培养基中的初始浓度均为5.0g·L-1,初始硝酸氮浓度均控制在150mg·L-1左右.然后按10%的接种量将X31种子培养液分别接入1000mLDM培养基中,30℃水浴培养.在这3种情况下,碳源都为菌体生长的非限制性条件.图2显示16h内各菌体的生长变化情况.从图2可以看出,X31菌株分别利用利用丁二酸钠、乙酸钠和苹果酸钠作为碳源时,能获得的最大菌体生物量分别为2.70、2.85和3.32g·L-1.当以这三者作为碳源时菌体生长都要经历约4h的生长延滞期,而后进入对数生长期.利用丁二酸钠的菌体生物量从4h的0.61g·L-1迅速上升到第10h的2.63g·L-1;利用乙酸钠的菌体生物量则从4h的0.88g·L-1上升到第8h的2.85g·L-1;利用苹果酸钠的菌体生物量从第4h的0.7g·L-1快速增加到第10h的3.32g·L-1.由此可知,根据不同碳源在代谢中的地位不同,菌株X31对它们的利用率也有所不同.三者比较可知,菌株X31在利用苹果酸钠作为碳源时其生长量最大.图3为以丁二酸钠、乙酸钠和苹果酸钠作为电子供体时其对菌株X31的好氧反硝化性能影响.从图3可以看出,当以乙酸钠和丁二酸钠为电子供体时,其反硝化分别在8h和10h内完成.其中以丁二酸钠作为电子供体时,NO-3-N浓度可以由初始的149.10mg·L-1降到末期的4.01mg·L-1,而以乙酸钠作为电子供体时,NO-3-N浓度由初始的151mg·L-1降到末期的3.67mg·L-1.两者的脱氮率分别可以达到97.30%和97.57%左右.以苹果酸钠作为电子供体则是在第12h完成反硝化过程,并且其反硝化效率较前两者均低很多,其脱氮率在80%左右.同时实验结果显示,以这3种不同碳源分别作为电子供体时,在整个反硝化过程中均只有微量的亚硝酸盐出现,其最高值不超过1.5mg·L-1.3.2总氮去除率比较试验中以丁二酸钠提供碳源,固定碳源浓度(TOC)为720mg·L-1,通过调整硝酸氮浓度来改变碳氮比(TOC/N),使C/N质量比分别为20、14、9、6、5、4、3、1.5和1.0,结果见图4.从图4中可以看出,在C/N为1.0时,总氮去除率仅为22.69%;当C/N增加到5时,总氮去除率达到了89.50%.在C/N小于5的情况下,脱氮率随着C/N比的增加而快速增长.这主要是因为初始的碳源越充足,菌体的生长速度越快.当C/N为6时,脱氮率增加到95.30%,进一步增加碳氮比,脱氮率基本上没有多大变化.可见当C/N大于5时,基本能够进行完全的反硝化.图5为不同C/N情况下以丁二酸钠为电子供体时硝酸盐的还原过程.从图5可以看出,虽然C/N不同,也就是初始硝酸盐浓度不同,但是当利用丁二酸钠作为电子供体时,硝酸盐的还原都会大致经过4h的延滞期,在培养的第4～10h时,硝酸盐含量快速下降.图6所示为C/N为6时以丁二酸钠为电子供体时,菌株X31的完全反硝化过程,可以看出,硝酸盐含量的快速下降和氮气的产生都主要发生在第4～10h.4碳源对反硝化效率的影响由图3可知,3种碳源中以丁二酸钠和乙酸钠作为电子供体时,能获得较高的脱氮效率,并且乙酸钠较丁二酸钠作为电子供体时,其反硝化速率更快.实验结果表明,以乙酸钠作为电子供体时,菌株X31的反硝化速率为11.86mg·g-1·h-1,这要稍高于利用丁二酸钠作为电子供体时的反硝化速率(11.53mg·g-1·h-1),也远高于苹果酸钠作为电子供体时的反硝化速率(5.80mg·g-1·h-1).由此可见,利用乙酸钠作为碳源时,菌株X31中的硝酸盐还原酶活性最强.这可能是因为反硝化本身是个氧化还原反应,不同碳源本身在氧化还原中的位置不同会对反硝化作用产生影响.作为有机碳源来说,乙酸盐的还原性要大于丁二酸盐和苹果酸盐,而乙酸钠的分子结构较丁二酸钠和苹果酸钠更为简单,也更容易被微生物所利用,所以,微生物利用前者产生能量更快,反硝化效率更高.反硝化效率不仅受碳源浓度所影响,而且也受电子供体本身的性质所影响.这和Her得出的结论是一致的(Heretal.,1995).Her等人的研究表明,所用碳源的化学结构和分子量对反硝化效率的影响是很大的,通常结构越简单、分子量越小的碳源越有利于反硝化的进行.从图4可以看出,在不同的C/N质量比条件下,X31菌株的好氧反硝化能力亦不相同.有机碳源浓度对菌体生长和反硝化效率起着重要的作用.如果碳源不足,就没有足够的电子流来提供足够的能源以供菌体生长,相应的反硝化效率也会变低.但当提供的碳源远高于菌体的需求,此时碳源已非限制性因素,菌体的生长和代谢活性处于稳定阶段,反硝化脱氮效率也增加不多.从实验结果可以看出,最佳的碳氮比为5～6,此值略大于普通反硝化所需的碳氮比,这可能是因为菌株X31需求更多的能量来提供菌体生长和用于反硝化过程.根据Chiu等的研究(Chiuetal,2003),对于特定的菌株,选择不同碳源时相应的会存在不同的最佳碳氮比,这是因为其新陈代谢途径和面临的竞争在选用不同的碳源时都会存在不同.图5中的试验结果也显示,出水硝酸盐浓度随着C/N的降低而升高,这主要是因为在碳源受限制的情况下,菌株无法获得足够的碳源合成足够的反硝化酶系,使得反硝化进行的不完全所致.从图6可以看出,在最佳C/N为6的情况下,反硝化和氮气的产生都主要发生在培养的第4～10h.这是因为此阶段大致是菌株X31的对数生长期,也就是细菌生长和繁殖最旺盛的时期,同时也是其所需要的能量和还原力最多的时期,因此,反硝化作用主要在这一时期完成.这也证实了马放等先前的研究结果(马放,2005),即X31菌株在好氧条件下,以有机碳源作为电子供体,而以硝酸盐和氧气共同作为电子受体进行协同呼吸.另外,当C/N在1～14之间变化时,在菌株X31的硝酸盐还原过程中,均只有微量的亚硝酸盐出现.即便是在C/N为1时,此时虽然反硝化过程很不彻底,但硝酸盐还原过程中也没有出现亚硝酸盐大量累积的趋势,其亚硝酸盐含量最高不超过2.4mg·L-1.经分析作者认为,这主要是因为X31菌株中的亚硝酸盐还原酶活性很高,经菌体硝酸盐还原酶产生的亚硝酸盐,在很高活性的亚硝酸盐还原酶作用下也被迅速还原.5以苹果酸钠和乙酸钠为电子供体的反硝化速率1)X31菌株分别利用丁二酸钠、乙酸钠和苹果酸钠作为碳源时,能获得的最大菌体生物量分别为2.70、2.85和3.32g·L-1.2)菌株X31以丁二酸钠和乙酸钠作为电子供体时,其脱氮效率可以分别达到97.3%和97.