方法学评价实验--重复性实验

实验四方法学评价实验—重复性实验二方法学评价实验-重复性试验

1、精密度：是指同一标本在一定条件下多次重复测定得到的一系列单次测定值之间接近程度。反应随机误差大小的指标，重复性试验是评价方法精密度的常用方法。2、重复性试验：将同一份标本分成数份实验标本，进行多次分析测定（一般为20次），目的在于评价或验证试验方法的随机误差或不精密度。3、批内重复性试验：在尽可能短的时间内进行5轮，每轮4次测定4、日内重复性试验：在一天内作5轮，每轮4次，获得20个数据。5、日间重复性试验：每天测定一份，连测20天。原理将同一份标本分成数份，在相同条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作），在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法（一般为20次，5轮，每轮4次）。其结果能反映各次测定结果互相接近的程度，用于客观评价测定方法随机误差的大小。一、己糖激酶法测定血清葡萄糖HK法测定葡萄糖的原理还原型NADPH的生成与葡萄糖浓度成正比，在波长340nm监测NADPH吸光度，可计算血清中葡萄糖的含量。葡萄糖 + ATP←－－→葡萄糖-6-磷酸+ ADP己糖激酶葡萄糖-6-磷酸+NADP+←－－－－－－→6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+葡萄糖-6-磷酸脱氢酶HK法测定血清葡萄糖试剂盒5.55mmol/L葡萄糖标准液分光光度计水浴箱试管、吸管等临床样本：根据医学决定水平收集临床混合血清样本三份（2.8、6.7、11.1mmol/L）（无肉眼可见溶血、脂血、黄疸）【试剂与器材】HK工作液配制：4R1+1R2

HK法加入物质（ml）B（空白管）S（标准管）U（标本管）血清0.02葡萄糖标准液0.02去离子水0.02HK工作液1.01.01.0混匀，37℃水浴，10分钟，340nm测吸光度微量进样器量程0-100μl

↓↓0μl20μl【注意事项】1.测定标本以草酸钾-氟化钠为抗凝剂的血浆较好。因为其不仅能抗凝，还能抑制糖分解2.本法用血量甚微，操作中应先加试剂后加标本，再吸试剂反复冲洗吸管（3次）3.使用微量进样器前应浸在溶液中来回拉几次，将针尖内气泡排尽。使用时容量指示芯拉动不得超过商标图案，谨防拉出。使用后应立刻进行清洗，防止芯子卡死、针尖堵塞。

次数轮数123412345血清样本按照前述HK法血糖测定方法进行20次（5轮4次）平行测定。【操作步骤】【原始数据记录】【数据处理】

Au

血清葡萄糖（mmol/L）=×5.55As

次数轮数1234123451.检验20次测定数据中的离群值，如存在异常值应剔除。对小样本量的测定，可以用Grubbs检验，其统计学公式是：

Xd为离群值；X、s分别为包括离群值在内的均值、标准差，如果计算的G值大于系数表中相应显著性水平的a和测定次数n时的临界值Ga.n，则将Xd作为异常值舍去。G=测定次数显著性水平测定次数显著性水平(n)0.050.01(n)0.050.01112.2342.484372.8343.204122.2852.549382.8453.216132.3312.607392.8563.228142.3722.658402.8673.239152.4092.705412.8773.250162.4432.747422.8863.261172.4752.785432.8963.272182.5042.821442.9053.282192.5312.853452.9143.292202.5572.884462.9233.301212.5802.912472.9313.310222.6032.939482.9403.319232.6242.963492.9483.328242.6442.987502.9563.337252.6633.009603.033.41（1）只有一个离群值的情况：设有n个测定数（X1<‥<Xn)，其中X1为离群值，即可利用上述公式，直接对X1进行检验。（2）如果离群值是两个或两个以上，分布在均数的同一侧，例如X1、X2都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据（X2），即通过检验决定X2是否应该舍弃。如果X2应该舍弃，X1自然该舍弃。如果X2不应舍去，再检验X1。（3）如果离群值是两个或两个以上，分布于均数两侧，则分别检验X1和Xn是否应该舍去。如有一个数据决定舍去，那么再检验另一个数据时，测定次数应该作为减少一次来处理，而且此时应选择99%的置信水平式中Si2为5轮各次测定值的方差，即：Si2=(3)变异系数(CV%)＝×100%（1）批内均数=（2）批内标准差（Sw）=2.按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数、标准差(S)和变异系数(CV

)【评价标准】

批内不精密度的判断限是1/4允许总误差（TEa）范围，小于或等于判断限的，检测系统的不精密度可接受；大于判断限的表示不精密度不符合要求。允许误差范围可根据CLIA88规定的能力比对试验的TEa确定，血糖的可接受范围是靶值±0.33mmol/L，或CV<2.5%则方法精密度可接受。TEa=±1/4[（参考值上限–参考值下限）/参考值均值]×100%【注意事项】1.为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加人标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数。

2.引起偶然误差的原因很多，仪器、温度、吸量、混匀、标准品的稳定性等等，应排除这些因素后才能把误差归于方法学。3.用于评价方法精密度的变异系数应该是剔除离群值之后计算得到的。医学决定水平2.8、7.0、11.2mmol/L（6.7？？？）

美国实验室临床实验室修正案CLIA^88推荐的临床化学项目的允许总误差TEa

医学决定水平2.8mmol/L7.0mmol/L11.2mmol/L

TEa0.336μmol/L10%10%

批内不精密度CV变异系数或标准差小于或等于TEa的1/4

所以1/4*10%=2.5%即CV小于等于2.5%？？？？

严重溶血Hb2-5.12g/L致使红细胞内有机磷脂酸及一些酶类释放，消耗NADP+，可使葡萄糖测定值下降。

精密度通常以“不精密度”【标准差和变异系数