氯原酸对常见呼吸道病毒体外抑菌的研究

氯原酸对常见呼吸道病毒体外抑菌的研究

氯原酸是蜂蜜的主要有效成分，也被称为咖啡酸。随着我们对“双黄连气雾剂”的深入研究，氯原酸的系统研究已成为这个主题的第一学期。特别是近年来，在世界范围内爆发的甲状腺素引起的全球效应中，我们必须找到有效的抗高血压药物问题。药理研究证明,氯原酸具有一定的抗病毒作用,但对其抑制具体病毒的研究并不多见,因此,我们在提纯氯原酸的基础上,对其进行了相关体外药效学试验,本文旨在探讨金银花所含的氯原酸在体外对常见呼吸道病毒的抑制作用,兹报道如下。1材料和方法1.1病毒病毒rsv和流感病毒美国Waters公司2010系列高效液相色谱系统(HPLC);日本岛津SHIMADZU十万分之一电子天平;氯原酸标准品(中国药品生物制品检定所);丹麦TL3072超净工作台;日本MODEL304二氧化碳孵箱;日本Olympas显微镜;合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ad3)、腺病毒7型(Ad7)、柯萨奇B组病毒3型(CB3)、柯萨奇B组病毒5型(CB5)、流感病毒甲3亚型(Fa3)、副流感病毒Ⅳ型(PF3)病毒由黑龙江省防疫站病毒研究所提供;对照药:双黄连粉针剂(哈尔滨中药二厂,批号:970676);病毒灵片(安徽淮南市第三制药厂,批号:102054)。1.2fa3、pf3病毒毒力检测(1)氯原酸由黑龙江中医药大学植化室用柱层析法从金银花中提取,经HPLC测定,色谱和光谱与标准品相同,提取纯度可达81.1%。(3)把病毒液用MEM细胞维持液做10倍系列稀释,以(2)相同方法测定RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒的毒力,以致培养细胞Hep-2病变达到50%计算TCID50;用红细胞凝集试验测定Fa3、PF3病毒的毒力,以鸡红细胞在V形微量滴定板孔底形成环状,周围有小凝块时的病毒悬液稀释度为1个单位的血凝素。(4)抗RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒实验用中和试验:取三种药,依据每药CC50,依次向下倍比稀释,取6个不同浓度,同时设病毒对照、细胞对照、药物对照。采用上述病毒的100TCID50与药物等量稀释后,接种已成单层细胞的96孔培养板,置孵箱培养1~5d,镜下判定结果。抗Fa3、PF3病毒实验用血凝抑制试验:3种药按各自CC50,分别取9个2倍系列稀释的药液,分别与4个单位的Fa3、PF3等量混合,振荡,在37℃作用1.5h后,在微量滴定板依次倍比用生理盐水稀释加入,另设红细胞对照,病毒对照,全部孔中各加1%鸡红细胞悬液0.5mL,45min后记录结果。以上试验均做二次,结果互参。2结果2.1药物细胞毒性试验的结果氯原酸CC50为0.78mg·mL-1,双黄连粉针CC50为1.563mg·mL-1,病毒灵CC50为6.25mg·mL-1。2.2终点度的判定判定结果标准:(1)RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒在中和试验中,以能保护50%的培养细胞不产生病变的最高稀释度,为判定药物抗病毒的终点滴度;(2)Fa3、PF3病毒采用的血凝抑制试验,以完全能抑制4单位Fa3、PF3所致的红细胞凝集的药物最高稀释度为判定终点滴度。结果见表1。3氯原酸的应用从以往的实验研究中,我们已经知道氯原酸的一些药效学作用,如一些文献报道的:氯原酸及其水解产物咖啡酸均具有广泛的抗菌作用、中枢兴奋作用;促进小肠蠕动及子宫兴奋作用;利胆作用;止血及升高白细胞作用等;其抗病毒作用,只报道过氯原酸抑制培养基中单纯疱疹病毒的实验[1~3]。从以上抗病毒实验结果我们可以看出,提纯的氯原酸细胞毒性虽增高,但其抗呼吸道常见病毒的效价亦高于双黄连粉针剂,明显高于病毒灵。由此提示,精制的双黄连作用,要好于未提纯的双黄连。同时,本文亦补充了国内体外氯原酸抗呼吸道病毒的范围。使我们对氯原酸有了更深入的了解。这对于中药金银花的开发及抗病毒中药双黄连的研究,无疑具有巨大的推动作用。通过这一实验我们知道,氯原酸对呼吸道最常见、最主要的合胞病毒、柯萨奇B组3型病毒等具有明显的抑制作用,强于双黄连粉针,浓度约0.05mg·mL-1即能体外抑制合胞病毒生长,浓度约0.1mg·mL-1即可抑制柯萨奇B组3型病毒的体外生长;对于腺病毒7型,浓度需0.4mg·mL-1可抑其体外生长;对于腺病毒3型和柯萨奇B组5型,浓度需0.8mg·mL-1可抑制其体外生长;对于我国东北地区冬季经常流行的流感病毒3亚型抑制作用较弱,浓度需12.5mg·mL-1才能体外抑制;对于副流感病毒Ⅳ型作用更弱,需50mg·mL-1才能体外抑制。临床应用多年的抗病毒药病毒灵在体外试验中疗效不佳。由此可以看出,提纯的氯原酸对于呼吸道最常见的几种病毒大多具有很好的体外抑制作用,这与主要含有氯原酸的金银花多应用于呼吸道病毒感染是紧密相连的,进一步说明氯原酸做为金银花的主要有效成分是有一定的实验与理论基础的。(2)分别取氯原酸、双黄连粉针、病毒灵的10%浓度液体150uL,用细胞维持液由高向低2倍系列稀释成各浓度液,每组药按不同浓度分装在10支离心管中,第