无菌检查微生物限度检查方法学验证实例

无菌检查、微生物

限度检查方法学

验证实例11/10/20231虎杖苷注射液无菌检查的方法验证

样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司提供，批号20040305。培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；霉菌液体培养基，批号040302；营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。11/10/20232方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证

验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。11/10/20233菌液制备：取经34℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。取经24℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100cfu/ml备用。11/10/20234

取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml，加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。

11/10/20235供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30ml溶解后，过滤。7.活菌计数活菌计数结果见表1。11/10/2023611/10/20237

方法验证直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。11/10/20238薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃­培养3～5d，逐日观察，结果见表2、3、4。

11/10/2023911/10/20231011/10/20231111/10/202312结论：根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。

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头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证

样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶；批号：；生产单位：AventisPharmaDeutschlandGmbH培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供)β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号：）11/10/202314验证试验用菌种：（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；(2)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；(3)大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]；(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；（5)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]；(6)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；

(7)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。

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仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号）北京牛牛基因有限公司。

方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验

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操作方法菌液制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中,32.5±2.5℃培养18～24小时；11/10/202317

取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。11/10/202318

白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3],25.5±2.5℃培养24～48小时。取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。

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将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃培养5～7d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加生理盐水10ml混匀备用。11/10/202320菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。

11/10/202321供试液制备：每2支以100ml生理盐水溶解，混匀备用。薄膜过滤：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。11/10/202322阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及真菌培养基2桶，100ml/桶。阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100ml，不加对照菌液，分别于30-35℃及23-28℃培养。11/10/202323

培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。结果细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。

11/10/202324表1细菌数计数

表2真菌数计数结果

菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

铜绿假单胞菌

生孢梭菌

计数(CFU)22263639626658542020均值(CFU)2438645620菌种黑曲霉菌

白色念珠菌

计数(CFU)86938683均值(CFU)898511/10/202325实验结果见表3和表4表3细菌实验结果(20小时观察)

11/10/202326表436小时观察真菌结果

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大肠埃希菌菌液制备：取经35℃培养19~20h的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取0.4ml加盐水10ml混匀，做活菌计数备用。

取12支样品，每2支以100ml生理盐水溶解，冲洗100ml每次，做冲300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基100ml和β-内酰胺酶2支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7）1ml。结果见表5。

11/10/202328表5实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU）

培养时间14h25h38h110h冲洗量300ml----冲洗量500ml--++冲洗量800ml-+++阳性对照++++11/10/202329结论：

头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为0.9％的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶量2支（大于300单位/ml）以大肠埃希菌为阳性对照菌。

11/10/202330复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验

样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。验证用菌种：

枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、

黑曲霉CMCC(F)98003。方法：

中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。

11/10/202331具体操作方法菌液制备：取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。(2)取经25℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。11/10/202332

取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，

用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。

供试液制备：

吸取样品10ml，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。

11/10/202333回收率测定：试验组:分别取不同品种的1：10供试液1ml、50~100个/ml试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌.(2)活菌组

测定每一菌株的试验菌数(3)供试液对照

测定供试品本底菌数(4)稀释剂对照组11/10/202334结果菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。11/10/202335表1菌落计数（cfu/ml）

实验次数金葡菌10-5枯草杆菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大肠埃希菌10-7194、90130、8073、72110、9014、15280、7445、23128、108110、12054、343153、15078、7773、74110、10030、2711/10/202336表2复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证

（常规法）

实验次数人工染菌回收率%金葡菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌10.0271.481.1100.0100.0229.229.4100.0100.0100.03抑菌抑菌100.0100.0100.011/10/202337从表2结果可以看出:（1）采用常规方法检验复方磷酸可待因溶液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%