中药提取液抗银屑病的作用机制研究

中药提取液抗银屑病的作用机制研究

在银屑病的表皮上有许多细胞因子，这些细胞因子可以刺激角质素（kc）对氟沙病样本的变化。肿瘤坏死因子tnf（i）和白介素-8（il-8）在癫痫的发病过程中发挥着重要作用。本研究选用治疗银屑病的常用药物制成单味中药提取液，采用体外细胞培养技术，观察了中药提取液对TNF-α刺激后KC生长的影响，并检测中药提取液对TNF-α刺激后KC分泌细胞因子IL-8的影响，探讨中药抗银屑病的作用机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞和起源人表皮鳞癌细胞株COLO-16，购自北京师范大学。1.1.2主试剂包括重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α，购自Promega公司）、人IL-8ELISA试剂盒（购自晶美生物工程有限公司）等。1.1.3特效药甲氨蝶呤、环孢素A标准品（98.8%）、中药饮片（经鉴定为国家药典规定品种）。1.2方法1.2.1水提液的配制将药物粉碎，过20目筛，超声提取上清液，蒸发浓缩为100%液，加2倍体积95%乙醇，放置48h，过滤，蒸馏乙醇，得到100%的水提液，调pH值为8.0，抽滤去除沉淀，装瓶密封，使用时调pH为7.0，过0.22μm滤膜除菌，加培养液配制成不同浓度的受试液。1.2.2中药组加入dmem、tnf-的检测培养的COLO-16细胞生长接近单层时，消化后经计数以每孔100μL(5×103个）接种于96孔板，于37℃，5%CO2培养箱培养。接种24h后，显微镜下观察细胞已贴壁生长良好，达40%～50%融合，吸出各孔上清及未贴壁细胞，空白对照组仅加入DMEM培养液，另一组仅加入TNF-α（100U/孔），其余各组均在加入TNF-α的同时加入药物，阳性对照组分别加入环孢素A和甲氨蝶呤，浓度均为5mg/L；中药组加入中药液浓度为10g/L。加药后继续培养48h，每天在倒置显微镜下观察生长情况。1.2.3实验2加药方法同上，但增设不加TNF-α刺激的阳性对照药组。加药后继续培养24h，测定细胞存活率，并收集上清液测定IL-8。1.2.4测定细胞活性的测定采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）。1.2.5il-8的测量用定量酶联免疫吸附法（E-LASA法）。1.3统计方法以细胞存活率（药物处理孔A值/培养液空白对照组A值）表示细胞繁殖程度，实验结果采用组间t检验。2结果2.1中药提取物对tnf刺激后24小时和48小时c的血浆扩散的影响见表1。中药苦参、全蟹对tnf-刺激的抑制作用(1)TNF-α刺激24h及48h后，对体外培养KC的生长具有促进作用，与空白对照组相比有明显差异（P<0.001）。(2）环孢素A及甲氨蝶呤对加入TNF-α后KC的增殖表现出抑制作用，与单加TNF-α刺激组比较具有明显差异（P<0.001）。(3)TNF-α刺激24h后，中药苦参、全蝎对TNF-α刺激24h后KC的生长具有抑制作用，与空白组及加TNF-α刺激组均有明显差异；丹参、赤芍也表现出抑制作用，与TNF-α刺激组比较具有明显差异，与空白组比较无明显差异；牡丹皮未表现出对KC生长的影响，与TNF-α刺激组相比无明显差异；金银花表现出促KC增殖的作用，与TNF-α刺激组相比具有明显差异。(4)TNF-α刺激48h后，8味中药均表现出显著的抑制KC生长作用。2.2在对tnf刺激后，中药提取物对kc产生了细胞因子il-8的影响见表2。tnf-类药物单次给药对il-8合成的抑制作用(1)TNF-α对KC分泌细胞因子IL-8具有促进作用，与空白对照组具有明显差异（P<0.01）。(2)8味中药中6味中药对TNF-α刺激KC分泌细胞因子IL-8的作用有抑制效果，其中拳参与单用TNF-α刺激组及空白对照组均有非常显著差异（P<0.001），牡丹皮、赤芍、金银花三味药物与TNF-α刺激组相比有比较明显差异（P<0.01），苦参、全蝎两味药物与TNF-α刺激组相比有显著性差异（P<0.05）。丹参表现出抑制IL-8分泌的趋势但经统计学处理无显著性差异。(3）环孢素A及甲氨蝶呤对TNF-α刺激细胞因子IL-8的分泌均有抑制的趋势，与TNF-α刺激组相比有明显差异，二者之间相比较抑制作用无明显差异；对空白组细胞因子IL-8的分泌有抑制趋势但统计结果无显著性差异。3联合用药对kc活性的影响银屑病是一种炎症增生性皮肤病，银屑病的主要病理表现即为KC异常增殖、分化不全及局部炎细胞浸润等炎症表现。研究发现，银屑病患者KC处于活化状态，分泌高水平细胞因子且增殖活跃。KC在受到白介素-1(IL-1）、TNF-α等刺激后可大量分泌IL-8。IL-8对中性粒细胞具有强烈的趋化作用，并可促进KC的增殖。研究发现，银屑病患者血清及皮损表皮内IL-8水平均明显增高，且与PASI积分相关。而在银屑病皮损基底层、棘层及颗粒层均表达IL-8基因，与皮损周边正常皮肤相比有明显差异，提示皮损处异常活化的KC为IL-8主要来源。有报道银屑病患者KC高度增殖与KC高分泌、高表达具有促增殖作用的IL-8及其受体CXCR2有关。TNF-α是一种炎性细胞因子，它可诱导KC合成IL-8，可促进KC和血管内皮细胞表达细胞间黏附分子，增强中性粒细胞对内皮细胞的黏附能力，从而促进炎症细胞在局部的浸润和活化。有报道银屑病患者皮损处TNF-α水平增高。研究发现银屑病患儿血清TNF-α、IL-8水平明显高于正常对照组，且TNF-α与IL-8水平呈正相关。本实验选择治疗银屑病的常用中药，观察了单味中药提取液对KC生长增殖及分泌细胞因子IL-8的影响。实验结果发现TNF-α能够刺激KC生长，并对其分泌细胞因子IL-8具有促进作用，与陈先进等报道一致。而8味中药全部对TNF-α刺激后KC的生长表现出显著抑制作用，其中牡丹皮、赤芍等6味中药同时对TNF-α刺激KC分泌细胞因子IL-8的作用有抑制效果，拳参、赤芍两味药物作用尤为明显。这6味中药中，拳参、金银花属清热解毒药；牡丹皮、赤芍属清热凉血药；苦参属祛风燥湿药；全蝎属攻毒熄风药，其中以清