全蝎不同工艺提取物抗凝血、溶栓作用的比较研究

全蝎不同工艺提取物抗凝血、溶栓作用的比较研究

蝎子是临床上常用的中药。它用于儿童的中风、痉挛、中风、全身痉挛和其他疾病。《中国药典》记载全蝎具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛等功效。目前全蝎临床一般以原粉、水煎煮、水煎醇沉等方法应用,存在服用量大、易被微生物污染等缺点。近年来研究发现采用电脉冲刺激等方式取得的蝎毒对血液有良好的抗凝作用,但蝎毒量少难得,价格昂贵,极大地限制了其推广应用。现代药理研究表明,动物类药材发挥作用的主要为其小肽类成分,因此,笔者拟采用酶解方法得到其小肽类成分,然后与上述几种常规方法所得提取液比较其抗凝血、溶栓作用与的差异。1实验材料1.1实验动物及药物昆明种小鼠,雌雄各半,体质量(20±2)g;Wistar大鼠,雌雄各半,体质量(200±20)g,均购自山东中医药大学实验动物中心,动物许可证号为:SCXK(鲁)20050015。1.2摇摆式高速中药粉碎机JJ-2型组织捣碎机(江苏江南仪器厂);摇摆式高速中药粉碎机(浙江大德中药器械有限公司);W-O型恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司)。1.3试剂:凝血酶-琼脂糖胃蛋白酶(酶活力>1200U/g),胰蛋白酶(酪蛋白转化力≥25.0),均购自国药集团化学试剂有限公司;牛纤维蛋白原(供凝血酶效价测定用)购自中检所(批号140626-200706),临用前配制为7mg/mL溶液;凝血酶(500U),购自浙江杭康药业有限公司,临用前配制为10U/mL溶液;琼脂糖,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;考马斯亮蓝R-250,购自上海展云化工有限公司,临用前配制为0.05%溶液;其余试剂均为分析纯;全蝎药材购自济南建联中药店,经本校周风琴教授鉴定系钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体,置干燥箱60℃以下真空干燥,粉碎成80目细粉,备用。2实验方法2.1试验溶液的制备2.1.1原粉混悬液的制备将100g全蝎细粉(80目)置于组织捣碎器中,加入10倍量水,10000r·min-1匀浆,持续10min,取出,等分为5份,取其中一份冷浸20min,定容至1mL∶1g(药液:生药,下同),过0.22μm微孔滤膜,即得原粉混悬液。2.1.2制备水ufeu取2.1.1项下所留样品液,煮沸30min,离心,残渣加8倍量水煮沸30min,离心,合并上清液,浓缩至1mL∶1g,均分为两份,一份过0.22μm微孔滤膜,即为水煎煮提取液,一份备用。2.1.3水提醇沉液的制备取2.1.2所留水提液,加入乙醇使含醇量达70%,冷藏过夜,抽滤,滤液减压回收乙醇,浓缩至1mL∶1g,过0.22μm微孔滤膜,即为水提醇沉液。2.1.4胃蛋白酶酶解液的制备取2.1.1项下所留样品液,煮沸15min,放冷,调节pH2.0,移至37℃恒温水浴锅中,保温10min,加入1%胃蛋白酶,2h后取出,离心,取上清液,浓缩至1mL∶1g,过0.22μm微孔滤膜,即得胃蛋白酶酶解液。2.1.5胰蛋白酶酶解液的制备取2.1.1项下所留样品液,煮沸15min,放冷,调pH7.5,移至55℃恒温水浴锅中,保温10min,加入1%胰蛋白酶,3h后取出,离心,取上清液,浓缩至1mL∶1g,过0.22μm微孔滤膜,即得胰蛋白酶酶解液。2.1.6仿生酶解液的制备取2.1.1项下所留样品液,煮沸15min,放冷,调节pH2.0,移至37℃恒温水浴锅中,保温10min,加入1%胃蛋白酶,2h后取出,调pH7.5,55℃恒温水浴锅中保温10min,加入1%胰蛋白酶,3h后取出,离心,取上清液,浓缩至1mL∶1g,过0.22μm微孔滤膜,即得仿生酶解液。2.2抗凝剂和溶胶剂的比较2.2.1贫血小板血浆ppp的制备大鼠腹腔静脉取血,3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝,混合后,离心15min(3000r·min-1),取上清液,得到贫血小板血浆(PPP)。分别取血浆0.1mL,加入上述供试品液0.1mL,混匀,37℃保温3min,再加入已预温至37℃的凝血酶溶液(10U/mL)0.2mL,混匀,记录出现絮状沉淀所需时间,即为凝血酶原时间(PT)。2.2.2凝血酶系统的制备取0.8g琼脂糖,加入磷酸盐缓冲液(pH7.6)100mL,加热使溶解,冷却至55℃,加入纤维蛋白原溶液(7mg/mL)8mL及凝血酶溶液(10U/mL)5mL,混匀,立即倒入已预热的培养皿中,待冷却后转移至7℃冰箱中放置20min,用直径0.5厘米打孔器打孔,即得。每个孔中均加入20μL不同上述样品液,以生理盐水、磷酸盐缓冲液(pH7.6)作空白对照,于37℃培养箱中培养22h。取出,用考马斯亮蓝R-250染色20min,脱色液脱色,观察纤维蛋白溶圈,记录溶圈垂直直径。2.2.3灌胃水处理组取昆明种小鼠70只,雌雄各半,体质量(20±2)g,随机分为7组,每组10只。样品液组灌胃给药,每天1次,给药剂量分别为10mL/kg,空白对照组灌胃给予同体积生理盐水,连续7天。末次给药1h后,用内径为1mm的玻璃毛细管插入小鼠眼眶内眦静脉丛取血,至毛细管血柱达10mm,每隔30s折断毛细管一段,检查有无出现凝血丝,计算毛细管采血到出现血凝丝时间,即为凝血时间。2.2.4不同给药剂量和给药量、时间取Wistar大鼠70只,雌雄各半,体质量(20±2)g,随机分为7组,每组10只。样品液组灌胃给药,每天1次,给药剂量分别为10mL/kg,空白对照组灌胃给予同体积生理盐水,连续7天。末次给药1h后,各组动物腹腔注射3.5%戊巴比妥钠麻醉,剖腹分离下腔静脉,于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管,造成瘀血,关闭腹腔。6h后再次打开腹腔,于结扎下方2cm处夹闭血管,纵行剖开,取出血栓,记录血栓重量。3结果3.1差异性试验结果表明,原粉冷浸液、水煎液、水煎醇沉液组凝血酶原时间与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05);各酶解组凝血酶原时间较原粉冷浸液组有较大延长,与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01),其中胃蛋白酶酶解组与原粉冷浸组比较有显著性差异(P<0.05),仿生酶解组与原粉冷浸组比较有极显著性差异(P<0.01)。3.2白对照组的显著性差异结果表明,原粉冷浸液、水煎液、水煎醇沉液组纤溶活性与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05);各酶解组纤溶活性与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01),其中仿生酶解组与原粉冷浸组比较有极显著性差异(P<0.01)。3.3两组患者显著性比较结果表明,原粉冷浸液、水煎液、水煎醇沉液组凝血时间与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05);各酶解组凝血时间与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01),其中仿生酶解组凝血时间与原粉冷浸组比较有显著性差异(P<0.05)。3.4p>0.05表达对应物的2.5结果表明,原粉冷浸液、水煎液、水煎醇沉液组血栓重量与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05);各酶解组血栓重量与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.01),其中胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组血栓重量与原粉冷浸组相比均有显著性差异(P<0.05),仿生酶解组血栓重量与原粉冷浸组相比有极显著性差异(P<0.01)。4中小型动物类药材与常规提取工艺的比较①全蝎药材经匀浆后,为使大分子蛋白受热变性,破坏其空间结构,从而易于蛋白质的水解,故先煮沸15min。②参考文献确定本实验中胃蛋白酶反应条件为37℃,pH2.0,时间2h;胰蛋白酶反应条件:55℃,pH7.5,时间3h。除比较单纯胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解方法外,另