半制备型高效液相色谱分离生姜中6-姜酚

半制备型高效液相色谱分离生姜中6-姜酚

作为生姜中最重要的药物活性成分，6-生姜酚具有多种药物活性物质：健胃与抗溃疡、肝脏保护、胆囊强化、消炎、中枢神经抑制作用、抗炎、肿瘤等。因此研究6-姜酚的分离提纯,无论对于进一步研究6-姜酚的性质,还是将其应用于临床都有着重要的意义。随着人们对天然药物的认同感和重视程度的日益提高,研制开发从植物中提取单体已成为一个具有广阔应用前景的发展方向。但是同其他植物药如紫杉醇已形成工业化生产并已应用于临床相比,6-姜酚的研制开发要相对滞后得多。从文献查阅情况来看,目前国内尚没有6-姜酚单体制备的报道。黄雪松用硅胶薄板层析结合葡聚糖凝胶层析法进行分离纯化,获得了姜酚的同系物。但是从探索一条能够制备高纯单体且能工业化生产的角度来考虑,此法尚存在两个难以解决的问题。一方面,薄板层析样品处理量小;另一方面,此法获得的不是单体,而是一组同系物。本文提出的6-姜酚分离提纯法,较好地解决了这两方面的问题,为将来较大规模生产进行了有益的尝试。1实验部分1.1仪器和分析方法高效液相色谱Hi-Tech7000LC;紫外可见分光光度计Lambd-a7型;气相色谱-质谱联用仪TraceGC-MS2000型;FT-IR红外吸收光谱仪EQUINOX55型;Millipore溶剂过滤系统。6-姜酚纯品;粗姜酚(自制);BKSOL1、BKSOL2为分析纯;实验用水为去离子水。1.2流动相及检测波长液相色谱柱:C18,20.0mm×300mm,15μm;流速:11.0mL·min-1;流动相:BKSOL1-水-BKSOL2(60+39+1);检测波长:280nm;进样量:0.5mL。1.3分离条件筛选以粗姜酚为样品,通过调节流动相的不同配比及流速,进行分离条件筛选,然后固定分离条件,改变进样体积,考查进样体积对分离的影响,最后在所选最优条件下,对6-姜酚进行分离。2结果与讨论2.1检测波长的确定取适量6-姜酚纯品,用色谱流动相溶解,测定6-姜酚在190~400nm区间的吸收光谱,发现它在230nm和280nm处有较大吸收,因为在230nm处检测器稳定性较差,且溶剂吸收峰干扰较大,所以本文选用280nm为检测波长。2.2流动相及bskol2的选择考虑到提纯出的6-姜酚是药用品,因此必需考虑残留试剂毒性的大小。另外,由于本文是在为将来较大规模生产摸索条件,生产的成本高低也是我们选择流动相的一个重要依据,所以,兼顾到生产成本和残留毒性,我们选择BKSOL1作流动相,同时加入BKSOL2以改善分离效果。2.3分离度的测定考察了BKSOL1体积比在35%~70%范围内变化对6-姜酚分离效果的影响。结果发现,在其它条件保持恒定的情况下,BKSOL1的体积比越大,6-姜酚出峰越快,分离周期越短,但是随之而来的是,分离度越低。BKSOL1体积比在35%~60%间变化时,对保留时间影响显著,当BKSOL1体积比增加至60%后,BKSOL1体积比的变化对保留时间的影响趋于平缓,考虑到保留时间,兼顾到分离度,最终选用的BKSOL1体积比为60%。2.4流动相bki比对分离的影响考虑到6-姜酚的弱酸性以及酚类物质的易氧化性,我们在流动相中添加少量的BKSOL2。结果表明:BKSOL2的加入不仅可以提高分离度和防止峰的拖尾,明显改善峰形,缩短分离周期,还可以提供酸性体系,防止6-姜酚在中性或碱性条件下的氧化,起到延缓6-姜酚氧化的作用。在流动相中分别加入0.0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%体积比的BKSOL2,结果表明:BKSOL2体积比在1.0%之前,对分离影响较大,随着BKSOL2体积比的增加,6-姜酚的保留时间缩短,分离选择性得到提高。BKSOL2体积比为1.0%或1.5%,对分离影响不大,从谱图上看不出明显差异。考虑到酸度大对柱寿命的影响,选择BKSOL2的添加比例为1.0%。2.5-姜酚的hplc测定8.0、9.0,10.0和11.0mL·min-1,保持其它条件不变,进行HPLC测定。结果发现:随着流速的增大,6-姜酚保留时间提前,分离度变小。当流速增加至9.0mL·min-1后,流速对分离周期的影响趋于平缓。从分离周期的角度考虑,兼顾到分离度,流速选择为:10.0mL·min-1。2.6对分离的影响在流动相组成为60%BKSOL1,流速10.0mL·min-1下,考查进样量分别为14.24、21.36、28.48、35.60、42.72mg时对分离的影响。结果表明,进样量在14.24~42.72mg范围内变化,对保留时间没有影响,但随着进样量的增加,谱峰逐渐变宽,分辨率逐渐降低,分离度减小,尤其是当进样量增至42.72mg后,谱峰展宽和拖尾现象严重,色谱分辨率和分离效果急剧下降,说明进样量已超出等温吸附的线性范围,因此进样量选择为30mg。2.76-姜酚的分离在上述所选分离条件下,对6-姜酚进行分离,色谱图如图1所示。从图1看出,此条件完全满足色谱分离制备要求,可基本实现基线分离。2.8