用带有STR的基因位点区别广东和福罗里达州的柑橘黄龙病菌种群

.页眉.页脚..用带有STR（短串联重复序列）的基因位点区别广东和福罗里达州的柑橘黄龙病菌种群摘要黄龙病是一种具有极大破坏性，并且威胁全球柑橘生产。这种疾病首先在100年前中国的广东地区发现，在2005年的美国的福罗里达州又发现了。与黄龙病相关的柑橘黄龙病菌在世界多处柑橘种植园区，包括广东和福罗里达州。全球的流行病-黄龙病，这种疾病的管理，都依赖于对黄龙病病菌在世界不同区域的了解。在本研究中，我们在黄龙病病菌的基因组中发现了小的串联重复序列，并且比较分析了广东和福罗里达州的的这种病菌中TRNs（串联重复序列编号）。通过分析这些编号，我们发现广东地区的细菌种群不同于福罗里达州的种群。广东地区的种群TRN绝大多数为7，频率为47.6%。福罗里达州的种群相对的TRN绝大多数为5，频率为84.4%。TRNs从3到16不等。这些TRNs值9,10,11,12的明显缺乏，将这些细菌性菌株分成两组：TRNs<10和TRNs>10两种。在福罗里达州，TRN<10的菌株大多数分布在感染黄龙病的国家。TRN>10株(6/109,或5.5%)是在佛罗里达中部地区发现的。这是第一份关于亚洲和北美黄龙病病菌比较的文件，而且证明了，两种不同地域分布的黄龙病病菌的基因型在福罗里达州的存在的可能性。关键字：基因型变异黄龙病是一种具有极大破坏性，并且威胁全球柑橘生产。这种疾病首先在19世纪末中国的广东地区发现，是一种地方病。黄龙病最近在福罗里达州报导过，引起了美国柑橘产业的关注。一个α-变形菌，黄龙病病菌首先从印度的感染黄龙病的树中鉴定出来。自此以后，在广东和福罗里达州发现很多参与黄龙病的病菌。不同地区关于黄龙病的柑橘病菌的多样性对于这种疾病的管理有全球的流行病影响意义。关于细菌菌群的多样性的了解有利于提高黄龙病管理策略的有效性，经济价值和稳定性，来减轻损失。目前，有限的生物和基因组的数据可以利用的，在划分不同地理区域起源的病菌种群多样性。分类学上，黄龙病病菌被一个在16srRNA上的印记序列定义。在这个基因组位点上病菌的变异是有限的，并且这个位点也不适合菌株的变异。其他的基因位点被用于细菌的鉴定，包括核糖体RNA蛋白的β操纵子和外膜蛋白基因。类似于这些16srRNA位点，核糖体RNA蛋白基因是高度保守的，并且不展现菌株的多样性。基于聚合酶链式反应(PCR），外膜蛋白位点的限制性片段长度的多态性，Bastianel等人从10个不同的国家分离了黄龙病病菌的菌株，虽然只有1。2个菌株代表每个地区。Deng等人最近在外膜蛋白基因内进行单核苷酸多态性分析，发现广东的菌株是泰国和尼泊尔分离来的，而不是来自菲律宾和中国北海。Tomimura等人分析了细菌噬菌体种类，DNA聚合酶序列，发现在南亚的病菌种群中有三个簇，一个是和印尼的种群相关两，另外两种和地域的分布没有关联。到目前为止，我们并没发现中国和美国黄龙病菌的相对的基因评价。一个重要的问题是适当的分子标记的需要。最近，有一个鸟枪法的病菌全基因序列被报导。这就可以获得更多的基因位点，来表征细菌种群的多样性。在有苛养木杆菌时，病原引起葡萄的皮尔斯病和杏叶的叶片枯黄病，分析导致位点识别的基因组序列，PD0218，一个丝氨酸蛋白酶含有串联重复序列ACDCCA。这个串联重复序列的编号在基因组位点中是高度可变的，导致从葡萄和杏叶中分离到高相似的G-基因型菌株。在本研究中，我们采取了类似的策略去表征从广东和福罗里达州采到的病菌的多样性。我们首先确定在病菌中基因组中含有的短串联重复序列的位点。研究在这个位点中得TRNs表明，广东的细菌种群明显不同于福罗里达州的。TRN的多样性在生物学和流行病学中得应用进行了讨论。材料和方法细菌的来源在本研究中，黄龙病病菌的菌株通过从有症状的叶子中提取的细菌DNA来描述和确定。带有黄龙病表样的柑橘叶子标本取自三个不同实验室:(1)广东，中国，华南农业大学(2)美国佛罗里达州农业与消费局植物产业处(FDACS-DPI),盖恩斯维尔(3)美国食糖公司/南方柑橘园林，(USSCSGC),克莱维斯顿，弗罗里达。华南农业的标本在2007年从广东省四个县的六个树丛中收集的。在这六个地区，有三个地区是在省的西部，是目前最主要的柑橘生产区，在这里黄龙病是传统的地方病。柑橘包括柚子，橙子，柑橘，枸桔。在弗罗里达，农业与消费局植物产业处(FDACS-DPI)的标本是在2009年的2月到2008年的3月从主要的柑橘生产区的29个国家获得的。主要包括礁莱檬，酸橙，柠檬，橙子，枸桔，广西沙柑，葡萄柚，和桔柚。美国食糖公司/南方柑橘园林(USSCSGC)的标本在2007年的7月到2008年的2月期间，在美国南部的7个城市的橙子中提取的。DNA的提取在广东，标本的获得是先将柑橘的叶主脉切除，利用前边提到的溴化方法将DNA提取出来。美国佛罗里达州农业与消费局植物产业处(FDACS-DPI)的标本是先取80~100mg的叶主脉和叶柄长枝条，美国BioSpec公司的小型珠磨器和植物DNeasy提取系统。美国食糖公司/南方柑橘园林(USSCSGC)的标本是按前边描述的过程提取的除了将DNA颗粒溶解在500ul的蒸馏水中。黄龙病病菌用OI1/OI2c和ITSAf/ITSAr两种设计引物进行PCR扩增来鉴定。把微生物免疫的DNA材料送到位于圣约魁谷农业科学中心的研究实验室，美国的农业研究服务部门，位于加利福尼亚州的parlier市，加拿大等部门检测。对细菌种群分析的引物和PCR流程黄龙病菌株psy62的序列从国家生物技术信息的基因库中获得。将CLIBASIA_01645基因选出来的原因是因为串联重复结构的出现。串联重复序列CLIBASIA_01645的引物是用引物3软件设计的。LapGP-1f和LapGP-1r的获得，它们对黄龙病病毒的特异性是在电脑中用BLASTn程序对比GenBank数据库检测到的，并且这个数据库包括许多著名的柑橘病原体。引物根据前边提到的过程是用于DNA的扩增。首先反应体系在TaKaRa公司热启动Taq系统中进行，含有25-μl混合物，其中含有2.5μl的10倍DNA聚合酶的缓冲,2.5μl2.5mMdNTPs,1μl的模板DNA,TaqDNA聚合酶0.2μl浓度为5U/μl和18.3μl的水。一个MJResearch公司DNAEngineTetrad2pcr仪设计首先1min的变性，再在以下条件下循环35个周期：96℃的情况下30秒，55℃30秒，72℃30秒。在最后一个循环后在72℃条件下延伸4分钟。将pcr的产物放在1.5%的琼脂凝胶中电泳，在紫外灯照射下经过溴化乙锭染色观察结果。DNA的测序和分析pcr的扩增产物用pcr中使用得引物在两个方向进行测序，利用的是BigDyeTerminatorv3.1循环测序试剂盒3130xl基因分析仪。手动计算串联重复序列的数量。不同TRN基因型的频率分别计算。细菌种群的区别利用统计学的χ2检验和Wilcoxonsigned-rank检验。结果总共，有174株黄龙病病菌进行了分析，65株来自广东省（5株柚子，19株甜橙，33株柑桔，2株和6株枸桔）和109株来自弗罗里达。在弗罗里达的菌株中，54株由佛罗里达州农业与消费局植物产业处(FDACS-DPI)取自29个国家，包括南部，中部和北部地区，55株由美国食糖公司/南方柑橘园林(USSCSGC)取自南部弗罗里达的7个国家。引物BLASTn搜索经鉴定符合了黄龙病CLIBASIA_01645序列。所有带有LapGP-1f/LapGP-1r引物设置的PCR阳性标本对带有引物设置ITSAf/ITSAr和OI1/OI2c都是阳性的。带有黄龙病特异性引物的弱扩增与利用引物位点LapGP-1f/LapGP-1r的微弱扩增关系密切。设计引物LapGP-1f/LapGP-1r特异性扩增来自黄龙病毒的DNA。在多数情况下,设计引物LapGP-1f/LapGP-1r产生类似的大约700bp的扩增子。同时,较大的扩增资也可以看到。核苷酸的序列分析证明了LapGP-1f/LapGP-1r扩增资的多样性。含有CLIBASIA_01645位点的黄龙病菌株psy62包含5个AGACACA短串联重复序列。经过对174株菌株的检测显示这个位点的TRNs值在3到16之间变动。在佛罗里达菌株,TRN值为5(TRN5)的菌株有84.4%的频率,其次是TRN值为4(TRN4)的占有相对较小的频率为4.5%。相比之下,在广东株中TRN值为7(TRN7)是最常见的(47.6%),其次是TRN6(TRN6)频率为29.2%。由于存在一些较小的预期值在χ2测试中，数据表1被分成三组类别:TRN≤5、TRN=6、TRN≥7。测试结果表明TRNs在广东和佛罗里达种间分布频率的有显著差异(P<0.001)。结果Wilcoxonsigned-rank测试九个TRN类别(表1)也显示两组种群之间也存在显著性差异(P<0.001)。分布在不同柑橘寄主的黄龙病毒TRNs值的在如下所示在图2中。TRN5TRN7甜橘(C.Sinensis),作为一个例子。在85个佛罗里达甜橙的病毒株里,73例(85.6%)是TRN5,没有一个是TRN7(0%)。在19株广东甜橙病毒株里,5例(26.3%)是TRN5，7例(36.8%)是TRN7。显然,甜橘对于鉴别TRN变种研究没有显著效果。基因型TRN9TRN10TRN11TRN12的缺乏将两地的黄龙病菌株分离成两组(表1):是一种大型TRN集团(TRN>10[TRN>10])和一个小TRN集团(TRN<10[TRN<10])。在广东种群中，2株(3.0%)TRN>10株被检测到了,相对的63菌株TRN<10(平均=6.4±0.9)。总之,6例(11.1%)TRN>10菌株存在于FDACS-DPI样品,所有这些都是来自佛罗里达中部，并且48株菌株TRN<10(平均=4.9±0.5)。取自USSCSGC的菌株样本都是TRN<10(平均=5.0±0.3)。广东菌株较大的标准偏差表明在广东的黄龙病菌种群比佛罗里达更多样化。广东和佛罗里达州两地区的TRN>10标准偏差没有预测到是由于小尺寸的样本量没有拿来讨论。CLIBASIA_01645是作为一种噬菌体阻遏蛋白C1注解的(11)。这个基因长672bp(223个氨基酸)。串联重复的核苷酸位置区域横跨从401到436。一个S24LexA-like肽酶部位被预测是由429到654核苷酸位置编码的。因为重复单元(AGACACA)在CLIBASIA_01645有7个bp,只添加或者删除三个单元(即21个核甘酸，编码RHKTQDT)才有能保证在框架中的基因的翻译。带有TRNs4、6、7的序列导致在468、462和486核苷酸位分别产生肽端。只有三株来自广东的框架中变异株带有TRN值为8的序列(表1)。在佛罗里达没有鉴定出框架中的变体菌株。讨论多年以来，自从第一次描述黄龙菌，黄龙病菌种群的多样性成为一个研究的挑战。基于rrn或rpl序列区分不同的地理源头的黄龙病菌株，对它们的基因组变化性检测,几乎毫无成效(7)。Omp位点的变异仅限于几种SNPs(1，7)，对种群分析不够有效和充分。在本研究中,我们参考以往的成功——区分密切相关的细菌菌株(5)和鉴定黄龙病毒基因组中一个带有串联重复序列的位点。这里提供的数据表明,这里提供的数据表明,广东和佛罗里达种群种间分布频率的TRNs是不同的。不同TRN基因型的共存表明黄龙病毒包含串联重复序列的发生的机制。在细菌中TRN变化的分子机制,通常认为与DNA滑脱(2，21，22)相关并且伴随着细菌的环境适应(3)。基因型TRN9TRN10TRN11TRN12的缺乏(见表1,图2)表明,可能有在黄龙病毒中存在TRN变化的两大机制。其中一种牵涉到在给定的时间一个单位的变化,导致了在TRN>10和TRN<10基因型中连续TRN变化。另一个机制涉及几个单元的复制或三体化，创建一个TRN>10菌株从一个TRN<10菌株。虽然真正的机制的需要得到证实,它还有待确定什么时候(频率)(例如,其它在寄主植物、昆虫媒介,这样在)在哪里TRN发生变化。此外,广东和佛罗里达存在主要的黄龙病毒TRN类型显示出对于不同细菌种群TRN7和TRN5的基因型的选择压力作用(未知的生物因素或者无机因素)。在广东的黄龙病毒种群较在佛罗里达州的多样化,与目前的了解——HLB已经广东要比在佛罗里达州存在时间长得多的是一致的。这也支持了黄龙病菌株是被引进到佛罗里达的结论。应该指出只鉴定了八菌TRN>10的黄龙病的菌株。这些菌株可能形成一个第二个比较局限性菌株群,但在这样一个明确的种群形成之前需要的分析更多的的菌株。我们推测当前佛罗里达州的黄龙病种群至少源自两个不同的地方。这TRN<10株菌株,主要是通过TRN5菌株,可能从源自一个未知的地区,然后通过柑橘树在整个佛罗里达传播。TRN>10的菌株可能后来引入佛罗里达中部地区,就像限制性传播提到的。另外，两组基因型群可能就是在同一时间或不同的时间引入佛罗里达中部地区,但以不同的速度传播。在任何情况下,都需要进一步的证明，而且，细菌引入次数依然是未知的。虽然TRN是一个菌株遗传变异非常灵敏的指标,但应该注意的是,选择的串