血液等体液标本的细菌学检验(鲍曼不动杆菌)

血液等体液标本的细菌学检验一、实验目的（一）掌握血标本的采集方法、检验程序（二）掌握鲍曼不动杆菌的分离培养与鉴定。（三）熟悉鲍曼不动杆菌的菌落特点、菌体形态及染色性。二、实验器材和试剂器材：酒精灯、火柴、取菌环、载玻片、普通光学显微镜、血平板试剂：3%过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、生理盐水、生化管药敏纸片：哌拉西林/他唑巴坦PIP/TA、替卡西林+克拉维酸TIC/CA、头孢他啶CAZ、头孢吡肟FEP、头孢噻肟CTX、头孢曲松CRO、阿米卡星AN、妥布霉素TM、美罗培南MPN、环丙沙星CIP三、实验内容（一）菌落观察（二）革兰染色法（三）氧化酶试验（四）接种生化管（五）菌种的综合判断四、实验步骤1、标本采集菌血症患者病原菌是周期性出现在血液中，尽管临床症状可能很严重，但患者血液中病原菌浓度水平相当低，因此要求临床多次采血液标本进行肉汤增菌培养，但24小时内一般不超过3次。怀疑为菌血症的患者，原则上应在抗菌药物使用前采取，对已开始抗菌药物治疗的患者可在下次给药前采取，标本大多由肘静脉采取，多部位采集血液标本也可增加阳性率。标本采集注意事项：

采血部位的皮肤消毒采用三步消毒法：即先用70%酒精擦拭皮肤，再用碘酒消毒，然后用70%酒精脱碘。采集的血液标本应分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养）和硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶中。硫酸镁葡萄糖肉汤中和多种抗生素，硫乙醇酸钠肉汤含有硫乙醇酸钠、葡萄糖等还原剂吸收其中的氧，为厌氧菌提供较低的氧化还原电位。血液与培养基的比例应为1：5—1：10儿童婴幼儿一般1-5ml成人一般10ml3、常见致病菌检验及报告方式（1）将血液细菌培养瓶置35度孵育，每日观察一次，连续观察至第七天。注意观察血液细菌培养瓶的变化。（2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查。如发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告（电话通知主管医生）。（3）根据涂片结果选择相应的抗菌药物，直接从血培养瓶抽取适量液体做初步药敏试验，并于18—24小时后报告初步药敏结果。（4）如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。包括需氧培养、真菌培养及厌氧培养。（5）对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性。革兰阴性杆菌：进行氧化酶试验并接种KIA培养基、O/F试验、生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验。革兰阳性球菌：葡萄串样或散在存在，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶阴性链状或散在排列初步判断为链球菌属或肠球菌属，作生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验。血液标本中常见的细菌革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、A群、B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、厌氧链球菌、革兰阳性杆菌：产单核李斯特菌、炭疽芽胞杆菌、产气荚膜杆菌。革兰阴性球菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌。革兰阴性杆菌：大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌等。（6）报告方式在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有XX细菌生长”；经分离培养、生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养X天，有XX细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌培养七天，无细菌生长”。注意事项1、一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉汤增菌液。2、对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目接种后无菌生长，方可报告阴性。注意事项3、为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目接种两次，第一次在标本孵育12—18小时后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种羊血平板和巧克力琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。革兰染色提示真菌生长，应移种至沙氏平板，L型菌须转种高渗平板。注意事项4、血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据，但血液标本在采集、接种、运送过程存在潜在污染的可能，尤其在静脉穿刺术中，因此皮肤消毒应严格按规程操作。5、一般菌血症由一种细菌引起，但约5%-10%的菌血症患者是多菌性菌血症。自动血培养仪原理：自动血培养检测系统是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳来作为血液中有无细菌的指标。检测技术有放射标记、颜色变化（CO2感受器）、荧光技术和压力检测等。自动血培养仪集培养、震荡和检测一体化。接种血液标本后，血培养瓶在培养、