测定核酸含量的几种方法

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为什么要测核酸含量

有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其他试剂含量的确定为了排除核酸在实验中的干扰Company

Logo第2页/共12页核酸含量测定的几种方法定磷法定糖法紫外吸收法荧光光度法Company

Logo第3页/共12页定磷法

在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝

钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷第4页量/共12页减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此Company

Logo可以计算出核酸含量。Company

Logo注意事项1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物第5页/共12页定糖法

核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。1、核糖的测定物在λ=670nm处有最大的吸收值。Company

Logo2、脱氧核糖的测定生成的绿色第6页化/共12合页注意事项其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽量可能除去。Company

Logo第7页/共12页紫外吸收法

组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为

250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以第8页/次共12页来计算核酸样品的浓度。Company

Logo荧光光度法即琼脂糖凝胶电泳法。

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng

DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。

该方法只是估计水第平9页/，共12页另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸Company

Logo分子的长度。小节

根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。根据需要设定一定的平行以

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