2023贝类脂溶性海洋生物毒素的检测

贝类 脂溶性海生物毒素的检液相色谱串联质法IIII目 次前言 III范围 1规性用件 1原理 1试和料 1仪设备 2样品 3试步骤 3结计与述 6精度 7附录A（料附）溶性洋物素 8附录B（料附）征离质色图 9附录C（范附）溶性洋物素毒因子 11PAGEPAGE10贝类 脂溶性海洋生物毒素的检液相色谱-串联质谱法范围11本标准适用于贝类体中脂溶性海洋生物毒素的检测。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。原理贝类样品经甲醇提取，碱性条件下水解释放酯化态生物毒素部分，用HLB固相萃取柱净化，液相色谱分离，串联质谱测定，外标曲线法定量。除非另有说明，以下所用试剂均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的一级水。甲酸（HCOOH）。（HCOONH4）。4.5 氨水（NH3•H2O）：浓度≥25%。（NaOH）。盐酸（HCL）：≥36%。2.5mol/L)：50g5002.5mol/L)：104.5mL500)：取30mL醇到70mL水混合匀室，用配。)：取20mL醇到80mL水混合匀室，用配。(0.3)：取0.3mL氨，甲容至100室，现配。（DTX1DTX2PTX2YTXhomo-YTXAZA1AZA2、AZA3GYM、SPX1≥97-20℃。（甲醇4.2）0.22μm5.12）20OA40g/m,DX140ngmL,TX240n/mL,YTX40ngmL,Hom-YX400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mLGYM10ng/mL,AZA1200ng/mLAZA2100ng/mL,AZA3100ng/mL。见（PTX2AZA1AZA2AZA3GYM（（OADTX1DTX2YTXhomo-YTX）0.22μm（5.12）20℃避光保存备用。各脂溶性海洋生物毒素的浓度见表1。表1脂溶性海洋生物毒素标准工作溶液（浓度单位：ng/mL）组别毒素简称浓度1浓度2浓度3浓度4浓度5正离子PTX250025012562.531.25AZA1100502512.56.26AZA2502525AZA3502525GYM250.3125SPX1100502512.56.26负离子OA201052.51.25DTXA201052.51.25DTX2201052.51.25YTX200100502512.5homo-YTX200100502512.5(ESI)。0.00001g。0.01。pH基质为含有N-30mg1mL，0.22μm样品2mm5100g提取称取2.009.0mL见1rpm离心10min209甲醇（见4.2）（4.2）20水解OA1.0125氢氧（4.7）0.5min76℃水浴40min125盐酸溶液（4.8）0.5min（5.12）后备用。净化1.0mL1.0mL30%1.0（7.1加2.81.0mL20%mL氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，摇匀后，0.22μm滤膜（4.17）过滤，液相色谱-7.3正离子模式测定PTX2AZA1AZA2AZA3GYM、SPX1C18，50mm2.5μmA：2mM50mMB：2mM50mM95%乙流速：0.3mL/min。柱温：25℃。10。0~4min，10%B80%B；4~6min80%B，6~6.5min线性变化10%B2.5min。OA、DTX1、DTX2YTX、homo-YTXC18，150mm×3.03.5μmb) (pH0.05%水溶液(pH。流速：0.4mL/min。柱温：4010。g) %B90%10%B4min。4500V。450℃（）；600℃（。5V。g）60L/min。h）50L/min。i）2。表2.离子对、锥孔电压和碰撞电压目标毒素母离子子离子锥孔电压V碰撞电压VOA803.5/563.2-80-60255.1DTX1817.5577.2-80-60255.2DTX2803.5577.2-80-60255.2homo-YTX1155.51075.5-12-45869.5YTX1141.51061.7-12-48855.5PTX-2876.5823.59039213.2AZA-1842.6824.611046806.6AZA-2856.5838.511046820.5AZA-3828.5810.511046792.3GYM508.4490.39535392.3SPX1692.4444.29040164.1毒素标准系列工作液（见4.13）分别注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应各毒素的峰面积，以标准工作液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。±2.5%。表3.定性测定相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至≤50%10%至≤20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%除不加试样外，按（7.1，7.2，7.3）步骤得到空白溶液，测定方法同（见7.4）。样品中各脂溶性海洋生物毒素的含量按公式(1)计算。iX i

c0)m

(1)式中：Xi——试样中脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)/湿重；ci——从标准工作曲线中得到的试样中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度(ng/mL)；c0——从标准工作曲线中得到的空白试验中脂溶性海洋生物毒素溶液浓度(ng/mL)；V——样品溶液最终定容体积(mL)；m——最终样品溶液所代表试样质量(g)；以重复性条件下平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数。脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附录C。样品中脂溶性海洋生物毒素的含量则按照毒性因子，Wneq

nWneqn

Xi1

(2)Wneq——表示各毒素(OAs、PTXs、AZAs、YTXs)的总毒力；Xi——表示相对应的脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)；ri——毒性因子。精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。本方法的批内相对标准偏差≤15%，实验室间相对标准偏差≤37%。其他本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg~200μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%~120%。表4.脂溶性海洋生物毒素定量限目标毒素定量限（μg/kg）OA6.6DTX19.9DTX213.2PTX279.2YTX85.8homo-YTX6.6AZA12.31AZA23.3AZA31.65GYM0.33SPX13.3附录A毒素简称中文名称英文名称分子式分子量毒素简称中文名称英文名称分子式分子量CASNo.OA冈田软海绵酸Okadaicacid(OA)C44H68O13805.0278111-17-8DTX1鳍藻毒素-1Dinophysistoxin-1C45H70O13819.0381720-10-7DTX2鳍藻毒素-2Dinophysistoxin-2C44H68O13805.00139933-46-3PTX-2扇贝毒素-2Pectenotoxin-2C47H70O14859.0797564-91-5YTX虾夷扇贝毒素YessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1homo-YTX类虾夷扇贝毒素1-HomoyessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1AZA-1原多甲藻酸-1Azaspiracid-1C47H71NO12842.1214899-21-5AZA-2原多甲藻酸-2Azaspiracid-2C48H73NO12856.1265996-92-7AZA-3原多甲藻酸-3Azaspiracid-3C46H69NO12828.04265996-93-8GYM环亚胺毒素GymnodimineC32H45NO4507.71173792-58-0SPX113-去甲螺旋内酯C13-Desmethyl-spirolideCC42H61NO7691.5334974-07-1附录B（）负离子和正离子模式下脂溶性海洋生物毒素特征离子色谱图如图B.1和图B.2所示。图B.1负离子模式下脂溶性海洋生物毒素混合标准品溶液特征离子质量色谱图图B.2正