【乙型脑炎病毒疫苗及检测方法综述5100字】

乙型脑炎病毒疫苗及检测方法研究进展综述TOC\o"1-2"\h\u181971乙脑病毒的结构 2200152乙型脑炎病毒疫苗的研究 2165122.1鼠脑组织活疫苗 291182.2地鼠肾细胞灭活疫苗 364652.3地鼠肾细胞减毒活疫苗 3132702.4SA14-14-2Vero细胞灭活疫苗IC51 3103182.5基因工程疫苗 367073乙型脑炎的检测方法研究 4170993.1血清学检测 4188433.2分子生物学检测 52774结语与展望 519931参考文献 6摘要：乙型脑炎是由乙脑病毒感染引起的以蚊媒为传播媒介的一种人兽共患虫媒病毒性疾病。该病主要在东南亚等地区广泛流行，我国亦是该病高发流行区域。感染该病毒后会造成患者以中枢神经系统损害，发热、头痛、脑膜炎等脑炎相关症状为主要特征。耐过患者亦会残留神经性后遗症，对生活造成严重影响。由于该病以蚊虫为媒介进行传播，防蚊，灭蚊及对受蚊媒威胁人群的潜在感染情况进行检测显得愈发重要。对于该病毒目前尚无有效的药物进行治疗，疫苗的免疫接种是预防该病传播的有效方法之一。本论文对乙型脑炎病毒的结构、当前相关疫苗及该病毒检测方式的研发进展进行了分析，总结当前已研发疫苗及检测方式的各项优缺点，从而为乙型脑炎的防控现状提供新的思路。关键词：乙型脑炎；病毒；疫苗；检测方法乙型脑炎（EncephalitisB）简称为乙脑，由日本乙型脑炎病毒引起的以蚊媒为传播媒介的一种人兽共患传染病，该病主要在东亚、东南亚等地区流行，易感于儿童或旅居者[1]。蚊媒叮咬是该病的主要传播方式，由此导致该病毒在人与猪、人与人之间不断传播，严重影响东亚、东南亚等地区文化旅游业的发展[2]。临床研究显示，亚洲每年约有5~17.5万人感染乙型脑炎病毒，感染乙脑后可引起患者中枢神经系统严重损害，并出现脑炎相关症状，如发热、头痛、脑膜炎等症状致死率接近25%，即使生存下来的患者也会有半数残留神经性后遗症，对未来生活造成严重影响[3]。由于乙脑对人和其他哺乳动物均产生严重危害，切目前临床尚未有特效药物对其实现完全根治，故而早期预防显得尤为重要。疫苗免疫接种是当前防治乙脑的重要手段，而尽早实现对乙脑病毒的检测是完成对其治疗的重要基础，故而有必要采取相应的方式对该类病毒进行准确检测并对患者进行确诊[4]。本研究在查阅既往文献的基础上对其进行综述，以为当前临床提供参考。1乙脑病毒的结构乙型脑炎病毒属黄病毒科（Flaviviridae），早在1935年在于日本被分离，颗粒为大小约50nm，球形，含包膜，病毒基因组为单股正链RNA，含一个10.3kb的开放式阅读框，病毒基因组首先转录和翻译出一个多聚体蛋白前体，随后在病毒及宿主细胞蛋白酶的催化下逐渐分裂并形成多类蛋白，包括3个蛋白结构及7个非蛋白结构[5]。衣壳蛋白（capsidprotein）、前膜蛋白（Premembraneprotein）和包膜糖蛋白（Envelopeglycoprotein）为主要结构蛋白。衣壳蛋白其作用是促进病毒的重组和复制。前膜蛋白在病毒感染后期逐渐发育成熟，并停留于内质网，最终和衣壳蛋白、包膜糖蛋白一起共同组成感染性病毒的核心。包膜糖蛋白由500个氨基酸残基构成，该蛋白包含E138、E176等位点，可增加乙脑病毒神经毒性及侵袭侵袭能力[6]。乙脑病毒的非结构蛋白包括7类。非结构蛋白中的NS1包含了352个氨基酸残基，能和可溶性补体结合，该蛋白可在感染细胞表面表达并分泌到细胞外部，使得机体防御系统受到刺激，从而让机体能对病毒进行中和，进而发挥保护作用[7]。NS2A、NS2B均属于低分子疏水性蛋白，其功能和侵入宿主细胞膜相关，在黄病毒属中同源性较低。NS3、NS4A、NS4B目前尚未完全了解其具体机制，NS5为分子量较大的碱性蛋白，其功能依赖于RNA的聚合酶活性，因而在病毒复制过程中可发挥重要作用。2乙型脑炎病毒疫苗的研究我国于上世纪60年代即开展乙型脑炎病毒疫苗的研究。其中随着临床应用鼠脑组织灭活疫苗和原代地鼠肾细胞减毒活疫苗得到国际许可。2.1鼠脑组织活疫苗第一代乙脑疫苗-鼠脑组织灭活疫苗于1930年首次研制，该疫苗应用北京株或中山株病毒接种鼠脑，并将鼠脑组织研磨获得悬液经甲醛灭活制作而成，。该疫苗的问世降低了亚洲各国乙脑的感染率，该疫苗在临床应用60多年后于美国获得接种许可，被用于1岁以上乙脑疫源地旅行的人群[8]。尽管该疫苗已被证明相对安全、有效，但报告显示，欧美国家中约有0.6%受种人群会产生副作用，因此不建议在亚洲感染地区旅行时将此疫苗用免疫接种。考虑到该疫苗的一些神经学副作用，日本于2005年中断了这种传统的灭活该小鼠脑疫苗的注射[9]。此外疫苗注射剂量大，生产成本高，故而存在明显不足。2.2地鼠肾细胞灭活疫苗该疫苗仅在中国生产和使用，未经纯化浓缩，含多种杂蛋白，故抗原含量较低，需要多次强化免疫才能维持一定抗体水平，但疫苗反复接种容易发生过敏反应[10]。该疫苗局部反应率低，仅为4%，全身反应小于1%，过敏反应为1/15000[11]。尚未被发现疫苗引起的脑炎。2.3地鼠肾细胞减毒活疫苗SA14142株是免疫原性良好、遗传稳定性高的高衰减株，适用于制备减毒活疫苗。1989年，成都生物制品研究所在初级仓鼠肾脏细胞中衰减了SA14-142。培养后提取病毒溶液，适量添加冻干明胶和蔗糖保护剂，成功研制出了弱化的日本脑炎疫苗SA14-14-2，该疫苗是目前人类唯一使用的活日本脑炎疫苗[12]。迄今为止，中国6亿次以上的剂量中使用了疫苗，其安全性和效果得到了确认[13]。该疫苗接种能产生体液免疫和细胞免疫，优于灭活疫苗。接种后，机体内增殖类似于自然感染，可刺激机体对病原体产生永久免疫。此外，疫苗副作用小，有轻度症状(极少数人有局部发红、偶尔发热、过敏性皮疹)，疫苗价格较低。但是，衰减的活疫苗容易受到母亲抗体的影响，容易引起宫内感染。孕妇和免疫缺陷者不建议接种疫苗这类疫苗，因为青年接种可能在一定程度上阻碍自身生长，并恢复活疫苗致病性[14]。2.4SA14-14-2Vero细胞灭活疫苗IC51IC51是接种了活性免疫的精制灭活日本脑炎疫苗，可以激活人类免疫，IC51疫苗局部/全身性不良反应发生率低，无严重过敏反应[15]。在美国、德国、奥地利观察到了18岁以上的Ic51疫苗。临床试验表明，接种疫苗后，98%的受试者可到达抗体以保护抗体，身体可产生免疫应答6年。83%的受试者在接种疫苗一年后出现保护性抗体。然而，日本脑炎的预防仅限于18岁以上的成年人，儿童接种ic51疫苗1至2年后的免疫力需要进一步观察[16]。2.5基因工程疫苗基因工程疫苗是主要由分子生物学技术开发的免疫防治药物，如DNA疫苗、弱毒化生嵌合病毒疫苗、亚单位疫苗、cDNA疫苗等。DNA疫苗可用于化合物免疫，在生物中表达天然蛋白质抗原，诱导有效免疫应答而不存在毒性逆转危险，并可制成含多种抗原的多价疫苗，具有防治乙脑病毒的优点。此外，DNA疫苗因其低生产成本、良好的稳定性和方便的储存而受到较多关注。当前乙脑DNA疫苗的研究主要体现在前膜蛋白、包膜糖蛋白及NS1的3个蛋白编码基因上，Ashok[17]将乙脑病毒编码E蛋白基因与TPA融合后构成载体，并将其以DNA形式注入到鼠脑，结果发现大鼠机体对乙脑病毒感染的保护率达到70%，因而DNA病毒疫苗能明显保护人体细胞免疫，使得机体避免受到乙脑病毒感染。开发嵌合病毒的主要原则是利用遗传工程技术，将稳定的衰减株作为受体株吸收，嵌入供体株对应的结构基因中。这样得到的嵌合病毒株不仅保持特定的衰减特性，而且对供体株具有免疫[18]。嵌合病毒疫苗株属于比单元疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗更有效的衰减活疫苗。嵌合疫苗的研发，在实施之前，必须熟悉病原体基因组各部分的基因序列位置和功能。因此，活衰减嵌合病毒疫苗是未来转基因日本脑炎疫苗研究的新领域。巴斯德公司通过将该病毒中的SA14-14-2毒株中的前膜蛋白、包膜糖蛋白去替代黄热病毒17D株cDNA的相应基因位点，从而研制出黄热-乙脑嵌合蛋白，且当前在不少研究者中开启了Ⅰ期和Ⅱ期试验，结果发现单次血清抗体阳转率超过97%，显示除了良好的安全性和免疫效果。该公司在2009年时已经向澳大利亚药品管理局和泰国食品药品管理局申请市场授权，且当前在美国、澳大利亚获取应用许可[19]。国内也有程度生物制品研究所开展了有关“乙脑登革3型嵌合病毒构建及生物学研究”，将乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2作为骨架进行研究，目前应用进展较为顺利，但有关其临床应用效果还需在后期实践中进行证实[20]。其余基因工程疫苗包括亚单位疫苗及cDNA疫苗等均在当前临床上发挥重要效果。3乙型脑炎的检测方法研究3.1血清学检测传统的血清学检验方式包括血凝抑制试验、补体结合试验等，但是对于该病的诊断费时费力，不能实现迅速诊断，特异性和敏感度均不高，双份标本采集有困难。酶联免疫法是临床用来检测乙型肝炎的重要方式，主要抽取血液标本或脑脊液标本进行检测。酶联免疫吸附法最早在1971年由瑞典学者Engvall和Perlmann[21]，荷兰学者VanWeerman和Schuurs[22]分别报道，主要根据抗原与抗体的特异性结合现象，可以利用酶与基质之间的催化作用和对待测物的定量测定，来同时测定抗原和抗体，属于一类特殊试剂分析方法。测定时，将待测样品和相应的抗原或抗体与载体上的复合物连接，催化基体与辣根过氧化物酶反应，改变反应液的颜色，并根据这种颜色差异实现对定量的判定。该方法在临床应用最为广泛，其优点主要体现在灵敏度高、特异性强、对人体无害三点上[23]。Barrows等[24]通过重组的乙型脑炎病毒前膜蛋白为酶联免疫法检测不同黄病毒间的较差抗体，从而实现对乙型脑炎等黄病毒的IgM血清动力学检测对感染和二次感染的脑炎均有较好的诊断敏感度，并且其可直接通过肉眼对颜色进行辨别，从而实现短时间内大批样品的检测。免疫荧光法可通过对患者血清中特异性IgM抗体进行检测来对患者进行确诊。通过对该方法建立相关识别参数，能明显提高对患者血清检测结果的准确性。张婷[25]将免疫荧光发用于当前乙脑患者乙脑-IgG抗体的筛查，发现其明显使得血清学特异性、荧光色素敏感性、显微镜检查法等手段集成一体，从而使得免疫学诊断结构被扩大，更好的被用于乙脑流行病学的调查。3.2分子生物学检测日本脑炎患者具有短期毒素病、长时间病毒检测分离和培养以及低阳性率。RT-PCR技术为病毒检测提供了早期、快速、高灵敏度和特定方法[26]。何博等[27]通过优化后的一步法RT-PCR扩增体系对该病毒进行扩增，从而实现对猪乙型脑炎的快速检测，使得达州市不同季节、不同养殖条件下乙型脑炎阳性率能更好的被检测，并且得出结论其有较高的灵敏度、特异度，且更为简单方便，使得研究者可以更好的对当地煮乙脑流行病特点进行掌握，从而完成综合性防控。牟小会等[28]通过RT-PCR对中国大陆已经上传的91株乙脑全基因组序列进行对比分析，从而对区域设计引物及探诊进行保守区域选择，实现对乙型脑炎不同基因组序列的重复验证比对，显示出良好的灵敏度和特异性。4结语与展望由于乙型脑炎在当前并无特效治疗手段，故而早期开展相应的疫苗开发及早期病毒检测技术的提升成为当前临床研究的热点。乙脑疫苗研发当前正处于一个更新换代的时期，新的疫苗在得到真正应用前，还有许多相应的实践需要被开展证实，因而随着当前新疫苗的开发及检测技术的进步，更为安全、副作用更小、接种程序更简单的疫苗将被越来越多的应用于临床，成为当前乙脑疫苗的发展方向。参考文献[1]蔡玉成,王小军,赵媛坤,等.2015-2020年甘肃省陇南市流行性乙型脑炎流行特征及健康人群抗体水平分析[J].中华地方病学杂志,2021,40(12):1011-1016.[2]郭红,杨文杰,王玖强,等.乙型脑炎减毒活疫苗单次病毒收获液冻融条件研究[J].国际生物制品学杂志,2021,44(06):315-317.[3]苑中芬,狄荻,李宗杰,等.我国乙型脑炎病毒优势基因型转换及其风险和对策[J].热带病与寄生虫学,2021,19(05):292-296.[4]孙肖瑜,郑晓春,魏晶娇,等.2016—2020年温州市流行性乙型脑炎流行特征分析[J].预防医学,2021,33(09):919-920.[5]吴德,谈琦琪,张欢,等.广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究[J].病毒学报,2018,34(5):638-645.[6]郭广超,周于用,武耀民,等.乙型脑炎病毒NS2A-C60A位点突变对其生物学特性影响研究[J].中国生物工程杂志,2020,40(9):1-10.郭彦军.流行性乙型脑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