生物技术制药

生物技术制药一、绪论生物技术制药（biotechdrug）：运用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药品。生物药品（biopharmaceutics）：生物技术药品与天然生化药品、微生物药品、海洋药品和生物制品的统称。生物技术药品的特性：①分子构造复杂；②含有种属特异性；③治疗针对性强、疗效高；④稳定性差；⑤基因稳定性；⑥免疫原性；⑦体内的半衰期短；⑧受体效应；⑨多效性和网络性效应；⑩生产系统复杂性以及质量控制的特殊性。生物技术制药特性：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。生物技术在制药中的应用：基因工程重组蛋白质及多肽药品、基因工程抗体、基因工程疫苗（蛋白质）、基因疫苗（核酸）、基因诊疗、基因治疗、动植物基因工程药品……二、基因工程制药表一基因工程药品类型举例免疫性蛋白多个抗原和单克隆抗体细胞因子干扰素、白细胞介素、表皮生长因子、凝血因子（血友病）蛋白质激素胰岛素、降钙素（治疗骨质疏松）、心钠素（心脏病）、生长激素酶类（尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂）（心梗、脑梗）、SOD基因体现1.1宿主菌的选择：高浓度、高产量、高产率；原料便宜；不致病、不产内毒素；发热量低，需氧低，适宜的发酵温度和细胞形态；易进行代谢调控；易进行重组DNA技术；产物易提纯。原核细胞大肠杆菌枯草芽孢杆菌链霉菌优点遗传背景清晰，操作简便，体现量大革阳，无致病性，可分泌体现工业，无致病性，可分泌体现，能对的折叠，可糖基化缺点无法分泌体现，提取困难；不能糖基化；N端多一种甲硫氨酸残基；产生内毒素；产生蛋白酶不能糖基化，蛋白酶降解产物，体现量低产品胰岛素、G-CSF、干扰素α、干扰素β-1b真：白介素-3、乙肝核心抗原、乙肝PreS2抗原；原：甘油激酶、纤维素酶、色氨酸合成酶真核细胞酵母丝状真菌优点周期短，工艺简朴，成本低，能糖基化，能分泌体现工业，分泌能力强，体现产量高，糖基化方式与真核类似缺点缺少强启动子，分泌效率差，过分糖基化，难以高密度发酵。（酿酒酵母；毕赤酵母，即甲醇营养型体现系统）非丝状真菌蛋白分泌率低，转化效率低，基因背景理解不充足，产物降解产品尿酸水解、胰高血糖素、GM-CSF、胰岛素、水蛭素、乙肝疫苗、HPV疫苗（防止宫颈癌）丝状真菌内源性蛋白，如工业或食用的酶1.2大肠杆菌体系中的基因体现必备条件：①载体能独立复制；②有克隆位点和筛选标记；③有强启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；④有阻遏子；⑤强终止子；⑥产生的mRNA含AUG和SD序列。启动子启动子类型特点lac（乳糖操纵子）阻遏蛋白基因（lacI）+启动基因（P）+操纵基因（O）+构造基因（Z/Y/A）。负控诱导Trp（色氨酸）负控阻遏，色氨酸含量低时转录taclac+trpλPL（噬菌体）负控诱导，温敏型，30℃时转录受阻，45℃时启动，活性比trp高11倍T7（噬菌体）只有T7RNA聚合酶可启动，可高效体现其它系统不能有效体现的基因影响目的基因在大肠杆菌中体现的因素①体现质粒的拷贝数和稳定性②外源基因的体现效率启动子的强弱重要影响因素，转录水平上影响基因体现核糖体结合位点（SD）的有效性SD序列最少含AGGAGG序列中的4个碱基SD序列和起始密码子ATG的间距9士3bp密码子构成密码子偏好性③体现产物的稳定性增加蛋白酶作用底物；组建融合基因；加入信号肽；变化真核蛋白二硫键位置；采用缺点型大肠杆菌。④细胞的代谢负荷将细胞的生长和外源基因的体现分成两个阶段。⑤工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中体现的形式融合蛋白短原核多肽（N）+真核蛋白（C），只作抗原使用，不作注射用药非融合蛋白细菌或噬菌体启动子-细菌核糖体结合位点（SD序列）-真核基因的起始密码子-构造基因-终止密码子。活性高，但易被蛋白酶水解分泌体现型蛋白碱性磷酸酶信号肽（PhoA）、膜外周质蛋白信号肽（OmpA）、霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）。不含氨基端的甲硫氨酸，产量低，信号肽不被切割或切割不精确1.3酵母体系中的基因体现外源基因的剂量/拷贝数外源基因的体现效率①启动子启动子类型所用的基因基因符号构成型磷酸甘油酸激酶PGK3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH乙醇脱氢酶ADH1，ADH2诱导型乙醇氧化酶AOX1半乳糖激酶GAL1②分泌信号的效率惯用酿酒酵母的A因子信号（alpha）和毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽。③终止序列的影响ADH1、CYC1、MF1和PGK优化基因内部构造外源蛋白的糖基化可发生N-糖苷键（天冬氨酰连接）和O-糖苷键（丝氨酸和苏氨酸连接）连接的两种不同的糖基化。制止外源蛋白降解①营养缺点型②添加蛋白酶底物（蛋白胨或酪蛋白水解物）③变化某些培养条件（pH）④突变外源蛋白基因的个别位点，变化其蛋白质序列中蛋白酶的作用部位。选择适宜的酵母生长密度基因工程菌的不稳定性及对策2.1质粒的不稳定性基因工程菌的稳定性最少应维持25代以上。类型有关因素分裂不稳定质粒丢失率（与宿主菌、质粒特性和培养条件有关）；比生长速率差别构造不稳定DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失质粒稳定性分析：通过比较在含有和不含抗生素培养基的菌体存活数，能够检测质粒的丢失率。2.2提高质粒稳定性的办法选择适宜的宿主菌适宜的载体选择压力①构建质粒时加入抗生素抗性基因②用营养缺点型细胞作为宿主菌分阶段控制培养控制培养条件温度、溶氧、pH、限制性营养物质浓度、有害代谢产物浓度、培养基组分。固定化大肠杆菌B（pTG201）培养代数丢失质粒的菌体固定细胞10-20代之后9%游离细胞85代60%基因工程菌中试工程菌选择发酵罐设计发酵培养基构成发酵工艺优化与参数监测控制重组工程菌的培养4.1基因工程菌的培养方式补料分批培养：溶氧在20%。持续培养透析培养固定化培养4.2基因工程菌的培养工艺影响因素培养基接种量取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度温度发生在复制、转录、翻译或低分子调节分子合成等水平上溶解氧DO2（氧输送）≥40%才干提高工程菌的生长，利于外源蛋白产生诱导剂诱导时机pH生长：6.8-7.4；体现：6.0-6.54.3基因工程菌的培养设备发酵罐规定：能获得高浓度的受体细胞和高体现的基因产物；培养过程不得污染，确保纯菌培养；培养及消毒过程不得游离出异物，不能干扰细菌代谢活动。高密度发酵5.1高密度发酵（highcell-densityfermentation）:普通指培养液中工程菌浓度在50g干重/L以上，最高值可达200g干重/L。5.2影响高密度发酵的因素：培养基、溶氧浓度、pH、温度、代谢副产物。5.3实现高密度发酵的办法发酵条件的改善培养基的选择建立流加式培养方式提高供氧能力构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌基因工程药品的分离纯化6.1分离纯化的基本过程6.2细胞的破碎办法物理破碎法高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法化学破碎法渗入冲击、增溶法、脂溶法生物破碎法酶溶法6.3固液分离离心沉淀膜过滤双水相萃取6.4重组蛋白质的分离纯化分离纯化重要依赖色谱分离法办法目的离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质（如病毒）阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等40nm微孔滤膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残存的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔滤膜过滤除菌6.5非蛋白类杂质的去除DNA的去除目的蛋白pI＞6.0，用阴离子吸附剂吸附DNA目的蛋白为强酸性，用阳离子吸附剂吸附蛋白质，而不让DNA被吸附热原质的去除重要是肠杆菌科所产生的细菌内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁的成分——脂多糖。超滤、渗入、色谱技术病毒的去除色谱分离、紫外线照射、过滤分离变性蛋白的复性7.1包含体/包涵体形成因素大肠杆菌高水平体现的重组蛋白在细胞内聚集而形成不溶的、无活性的固体颗粒。7.2包含体的分离和溶解包含体的分离包含体的溶解普通用强变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物；对含有半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸；加入金属螯合剂如EDTA以除去金属离子；30℃促溶7.3包含体蛋白复性办法稀释、透析复性法复性类型特点稀释直接加水或缓冲液，放置过夜透析通过逐步减少外透液浓度来控制变性剂去除速度超滤在生产中使用较多，规模较大含二硫键的蛋白的复性封闭蛋白的疏水簇增进复性凝胶过滤层析复性小分子添加剂增进的复性分子伴侣或折叠酶增进的复性人工分子伴侣增进的复性7.4大肠杆菌的体现产物包含体细菌收集与破碎包含体的分离、洗涤与溶解变性蛋白质的纯化重组蛋白质的复性天然蛋白质的分离分泌型的体现产物体积大、浓度低、需浓缩：沉淀法、超滤法浓缩蛋白产物的纯化办法合用范畴凝胶过滤相对分子质量差别大的杂质沉淀法溶解度差别大离子交换色谱电荷差别大疏水色谱疏水性强亲和色谱对配体的亲和力差别大细胞内可溶性体现产物亲和色谱分离：运用特异性的亲和配基离子交换色谱：电荷差别大的杂质细胞周质体现蛋白低浓度溶菌酶解决，渗入压裂解法。7.5基因工程药品的质量控制医药生物技术产品质量确保的普通性要点产品安全性评价产品本身的构造严格控制条件生物材料的质量控制目的基因体现载体宿主细胞培养过程的质量控制生产用细胞库原始种子批：确证克隆基因DNA序列，具体叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存于复苏时宿主载体体现系统的