发酵工程实验

PAGEPAGE5实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。2、了解市售酸奶的生产工艺。3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min4、接种：往冷却到43-45℃5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。6、发酵：发酵的温度保持在40-43℃发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70T°。2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃9、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。3）气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带4-6颗玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水三角瓶中，稀释至10－2，以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;③、倒培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h。⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/克。实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿，酸奶发酵瓶（自带）实验结果：详细描述自己制作的酸奶结果：答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较，比市场所售酸奶更稠密，酸奶的香味与酸味明显，制作成功记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据，计算最终平均值。答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落，全部为杂菌菌落，因此无法统计酸奶中的菌含量同时用图片记录实验过程中各现象与结果并对图进行注释。答：制备乳酸菌时，瓶子上方留有一部分空间，并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵，但乳酸菌是兼性厌氧菌，因此在存在少量氧气的环境中，乳酸菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输、保藏带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率？答：在基因水平上对乳酸菌进行基因重组，从而获得耐高温乳酸菌。在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上，对乳酸菌的基因进行修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。5、二氧化碳生成的检验（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；（2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定（1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2；（3）二氧化碳生成量=W1-W27、酒精生成的检验（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；（2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；（3）再加入1%K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色说明有酒精产生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3实验器材及试剂：菌种：活性干酵母试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶溶液：10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机实验结果：详细记录实验过程中各参数及数据。淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10g0.17g2.5g2.对实验结果的判断与分析。答:1二氧化碳生成的检验培养约48h后，观察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清浓度较稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡2酒精生成的检验打开瓶塞，闻到有浓重酒精气味。取发酵液5ml,加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。思考题：现有3株不同来源的酒精酵母，请设计与本实验操作不同的实验，判断哪株酵母发酵酒精能力最强？答：按实验步骤配制等量的三组醪液，加入等量糖化酶进行糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，向三组糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同来源的酒精酵母种液，相同条件下培养一段时间，分别测定三组实验产生的CO2的质量，进行比较。产CO2越多表示发酵酒精能力越强。实验四黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应（5学时）实验目的：1、了解黑曲霉固体发酵产酶情况2、掌握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法实验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。实验内容1、黑曲霉菌种活化（1）配制PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于PDA斜面，28℃培养5-7天，斜面上长满孢子。2、配制发酵培养基：15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%(NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌匀，装瓶；3、灭菌：121℃灭菌30min，冷却至室温。4、黑曲霉孢子悬浮液制备已培养好的黑曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。5、接种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液。7、酶活性测定（1）配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂，100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。（2）打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。（3）加样：往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。（4）培养（反应）：将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱，放置20小时左右。（5）观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。实验器材及试剂：菌种：黑曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述；答：固体培养基发酵前：培养基颜色较浅，各成分（麸皮、稻草）新鲜，粘度大成团状固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体，培养基营养成分被利用，体积缩小仔细观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。现象：纸片周围出现浅浅的水解圈，打孔培养基未出现水解圈，纸片直径2.5cm，水解圈3cm，直径比5:6思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？目前对纤维素降解有哪些研究进展？答：要想最大限度的利用纤维素，可从两个方面入手。一是通过生产高性能纤维素酶的方法，二是找到蕴含能量较高的纤维素。而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的获取，而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的新菌株。目前在纤维素的降解方面，微生物的研究较多，降解纤维素的真菌有很多，如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝，

菌丝具有很强的穿透能力，能穿透植物角质层的阻碍，紧紧依附和穿插在纤维物质上，

增大降解酶与纤维物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌。目前，木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属。实验五甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6学时）实验目的：了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制与固体发酵产酶进行比较分析实验原理甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成。当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。在纺织印染方面，利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。实验内容菌种活化（1）配制LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面，28℃培养2天。配制产酶培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉30g/L，以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121℃灭菌20分钟；菌悬液的制备已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。接种用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养72h。粗酶液提取：3000rpm离心收集得到粗酶液酶解底物分析：准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保温往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液1ml，另一个加入1ml蒸馏水（做空白对照）。以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g酶解反应30-60min，期间观察反应现象。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；答：①发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。②经过三天的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状仔细观察底物水解前后的现象。答：对照组：魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，实验难以继续。实验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。思考题：以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。答：原理：样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。方法：别向2支试管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保温5min。在其中一支试管中加入200μL稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置于50℃水浴中准确保温5min。加入3.0mLDNS试剂至两支试管中，搅拌均匀。在另一支试管（空白管）中加入200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。于540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。实验六从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。3、掌握微生物的基本操作。实验原理：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌（本实验加入重铬酸钾150㎎／L），霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，挑取纯菌落进行抗菌谱分析，指示菌为大肠杆菌（G-）和枯草芽孢杆菌（G+）。实验内容1、高氏一号培养基的制备可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟（实验中所用无菌器具均在此时灭菌）。2、土壤取样及其悬液梯度稀释选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。3、称土样10g于盛有90mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-1浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管4支，编号10-2、10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管3~4次，使与9ml水混匀，即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。4、稀释倒平板法分离土壤中放线菌取3支1毫升移液管分别从10-3、10-4、10-5菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-3、10-4、10-5的培养皿内，每一梯度两个平板。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充